RNA干擾survivin基因表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞放射敏感性影響

，，，

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 青島 266003 1 腫瘤科； 2 中心實(shí)驗(yàn)室)

原發(fā)性肝癌是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，目前早期肝癌主要治療手段以外科手術(shù)為主，但是90%肝癌病人因腫瘤較大或肝硬化而不宜手術(shù)。近年來(lái)，三維適形放療(3DCRT)技術(shù)大大提高了肝癌的放射劑量，從而提高了肝癌病人的生存率[1-2]。但同時(shí)其導(dǎo)致的放射性肝病限制了腫瘤放射劑量的增加。如何提高肝癌的放射敏感性是目前肝癌研究的一個(gè)重要方向。survivin基因是一種在腫瘤組織中高特異性表達(dá)而在分化正常的組織中沉默的凋亡抑制因子,該基因抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡并參與血管的生成[3]。survivin基因在肝癌細(xì)胞中高選擇性表達(dá)，與肝癌細(xì)胞放化療抵抗、復(fù)發(fā)及生存都密切相關(guān)，已成為肝癌診療的新靶點(diǎn)。RNA干擾技術(shù)常用于阻斷基因表達(dá)。本研究通過(guò)構(gòu)建靶向survivin基因的shRNA真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞，探討其對(duì)肝癌細(xì)胞放射敏感性影響，為RNA干擾survivin基因治療肝癌提供可行性依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑 胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品；RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司； Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒為Invitrogen公司產(chǎn)品；OPTI-MEM I優(yōu)化培養(yǎng)基由Invitrogen公司提供；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)相關(guān)試劑購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自Sigma公司；Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司。

1.1.2細(xì)胞株 人肝癌細(xì)胞株HepG2由我院中心實(shí)驗(yàn)室提供，在含體積分?jǐn)?shù)為0.10胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2溫箱中,2～3 d傳代一次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1重組質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)RNA設(shè)計(jì)原則及survivin基因(NM-001168)編碼序列，利用BLAST 進(jìn)行查詢，并以前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)[4]，特異性地合成1對(duì)針對(duì)survivin編碼序列的siRNA 片段，并構(gòu)建survivin基因的重組載體pshRNA-survivin-387，基因靶點(diǎn)位于survivin基因序列第387位點(diǎn)，靶基因的序列為5′-GAAAGTGCGCCGTGCCATC-3′。重組載體兩端設(shè)有Barn HI或Bbs I酶切位點(diǎn)，以利于與pGPH1-GFP-Neo載體連接。按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，同時(shí)合成陰性對(duì)照表達(dá)載體pshRNA-survivin-NC及陽(yáng)性對(duì)照表達(dá)載體pshRNA-survivin-GAPDH，以上載體均由上海吉瑪公司構(gòu)建。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞后可表達(dá)綠色熒光蛋白，用熒光顯微鏡可確定轉(zhuǎn)染效率。

1.2.2細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前24 h,取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，傳代接種于6孔板，每孔加2 mL無(wú)抗完全培養(yǎng)基，使每孔細(xì)胞數(shù)約5×105個(gè)，在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合度達(dá)70%～90%。分別設(shè)置空白對(duì)照組(不加液體)、陰性對(duì)照組(每孔加入psh-RNA-survivin-NC 4 μg)、siRNA轉(zhuǎn)染組(每孔加pshRNA-survivin-387為4 μg)。每組各設(shè)5個(gè)復(fù)孔，轉(zhuǎn)染過(guò)程按Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。質(zhì)粒與脂質(zhì)體的比例為1∶2.5(m∶V)。轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，孵育4～6 h后除去復(fù)合物，更換培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染24～48 h后于熒光顯微鏡下計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3RT-PCR技術(shù)檢測(cè)survivin mRNA水平轉(zhuǎn)染48 h后分別收集3組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為107/L，采用TrizoL法提取總RNA。RT反應(yīng)體系為20 μL(包括提取的RNA 2 μL，PrimescriptRTase 1 μL、OligodT 1 μL、dNTP 1 μL和適量5×RTbuffer、氯化鎂)，混勻，于PCR儀上行RT反應(yīng)，反應(yīng)條件：42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，終止反應(yīng)合成cDNA。PCR擴(kuò)增體系體積為50 μL，反應(yīng)條件：94 ℃變性30 s；55 ℃退火45 s，72 ℃延伸 1 min，共35個(gè)循環(huán)。取PCR產(chǎn)物，在含EB的20 g/L的瓊脂糖凝膠中電泳分離后，以凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。PCR擴(kuò)增引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，上游引物序列：5′-TCAAGGACCACCGCATCTCTA-3′，下游引物序列：5′-CCAGCTCCTTGAAGCAGAAGAA-3′。以GAPDH 為內(nèi)參照。用分析軟件進(jìn)行相對(duì)定量分析，survivin mRNA水平以survivin產(chǎn)物量/GAPDH mRNA產(chǎn)物量的比值表示。

1.2.4X線照射 收集siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，在6 MV直線加速器下給予6 Gy X線照射，再設(shè)置空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、siRNA轉(zhuǎn)染組、X線照射組，分別接種于6孔板中，使每孔細(xì)胞數(shù)為2×109/L，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.5細(xì)胞凋亡率的檢測(cè) 培養(yǎng)48 h后將各組細(xì)胞收集到試管中，制備細(xì)胞懸液使其細(xì)胞數(shù)約為1×106個(gè)，置體積分?jǐn)?shù)0.70的冰浴預(yù)冷乙醇中，4 ℃固定24 h，離心3 min沉淀細(xì)胞，去除上清液，加入1 mL冰浴預(yù)冷PBS，重懸細(xì)胞，再次離心去上清液，每管細(xì)胞加入0.5 mL碘化丙啶染色液(含RNA酶)，緩慢并充分重懸細(xì)胞沉淀，37 ℃避光溫浴30 min，4 ℃避光保存。用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行DNA含量測(cè)定，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，根據(jù)DNA含量的分布情況進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析。細(xì)胞凋亡率=亞二倍峰細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.6MTT法測(cè)定細(xì)胞存活分?jǐn)?shù) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×107/L。將細(xì)胞接種于96孔板，每孔加入200 μL細(xì)胞，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。每孔加入5 g/L的MTT各20 μL，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)。離心去上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，在酶標(biāo)儀上于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度值。細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)用實(shí)驗(yàn)組的平均吸光值與空白對(duì)照組的平均吸光值的比值表示。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染效率

48 h后表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率為60%～80%。

2.2 各組survivin mRNA水平比較

轉(zhuǎn)染48 h后空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞suvivin mRNA的水平分別為0.319±0.009、0.310±0.007、0.195±0.008，siRNA轉(zhuǎn)染組survivin mRNA水平與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較顯著下降，差異有顯著性(F=218.931，q=17.73、18.66，P<0.05)；空白組與陰性組比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)。

2.3 各組細(xì)胞凋亡率比較

空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、siRNA轉(zhuǎn)染組、X線照射組、siRNA轉(zhuǎn)染+X線照射組細(xì)胞凋亡率分別為(4.39±0.12)%、(4.31±0.33)%、(9.01±0.33)%、(21.17±0.73)%、(29.52±0.75)%，siRNA轉(zhuǎn)染+X線照射組細(xì)胞凋亡率明顯高于其他各組，差異有顯著性(F=1 421.83，q=13.81～57.48，P<0.05)；siRNA轉(zhuǎn)染組及X線照射組與空白組、陰性組比較，細(xì)胞凋亡率也明顯提高(q=17.55～39.10，P<0.05)。

2.4 各組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)比較

空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、siRNA轉(zhuǎn)染組、X線照射組、siRNA轉(zhuǎn)染+X線照射組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)分別為(95.25±1.41)%、(92.37±1.37)%、(80.96±0.89)%、(30.84±0.55)%、(19.74±1.13)%，siRNA轉(zhuǎn)染+X線照射組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)顯著低于其他各組，差異有顯著性(F=2 870.578，q=15.32～72.51，P<0.05)；siRNA轉(zhuǎn)染組及單純X線照射組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)與空白組、陰性組比較也明顯降低(q=11.14～73.90，P<0.05)。

3 討 論

survivin是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種凋亡抑制基因，屬于凋亡抑制蛋白家族(IAPs)新成員，其在胚胎組織及腫瘤組織中表達(dá)。王滋宗等[5]的研究結(jié)果表明，Caspase-3基因表達(dá)與survivin基因表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。靳秋月等[6]研究顯示，在結(jié)腸癌細(xì)胞中survivin通過(guò)抑制Caspase-3活性，在凋亡途徑的下游發(fā)揮抗凋亡作用。近年來(lái)研究顯示，survivin在肝癌組織中大量表達(dá)。MORINAGA等[7]研究證實(shí)了survivin基因高表達(dá)與肝癌發(fā)生有密切關(guān)系。RNA干擾(RNAi)技術(shù)是近年來(lái)產(chǎn)生的新興生物技術(shù)，即將目的基因所對(duì)應(yīng)的小分子雙鏈 (dsRNA)導(dǎo)入生物體并導(dǎo)致相應(yīng)mRNA降解，從而阻斷哺乳動(dòng)物細(xì)胞中特定基因表達(dá)。與傳統(tǒng)基因沉寂療法相比，其主要優(yōu)點(diǎn)為特異性強(qiáng)、抑制率高、方法便捷，在實(shí)驗(yàn)研究、抗腫瘤基因治療等方面具有廣泛的應(yīng)用前景。

肝癌在我國(guó)發(fā)病率較高，其臨床特點(diǎn)為病程短、進(jìn)展快、預(yù)后較差，病死率在消化系統(tǒng)腫瘤中居第3位，傳統(tǒng)治療的中遠(yuǎn)期療效均不理想。放射治療作為腫瘤三大常規(guī)治療手段之一，在肝癌治療中的地位卻十分有限，主要原因?yàn)榉派湫愿尾∠拗屏四[瘤放射劑量的增加。以往研究提示，survivin在肝癌組織中高選擇性表達(dá)，該特性為其在原發(fā)性肝癌中的治療靶點(diǎn)作用提供了理論依據(jù)。目前大量研究表明，抑制survivin基因表達(dá)可促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡及提高化療藥物敏感性[8]。但對(duì)于抑制survivin基因表達(dá)對(duì)放療敏感性的研究仍然較少。

本研究通過(guò)構(gòu)建siRNA真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞并經(jīng)X線照射后進(jìn)行細(xì)胞效應(yīng)研究。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pshRNA-survivin-387的HepG2細(xì)胞能顯著下調(diào)survivin mRNA的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，siRNA轉(zhuǎn)染+X線照射組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)顯著低于siRNA轉(zhuǎn)染組，細(xì)胞凋亡率明顯升高，提高了肝癌細(xì)胞的放療敏感性。MEYN等[9]研究顯示，腫瘤受單一劑量照射后凋亡指數(shù)與放射敏感性呈顯著正相關(guān)。提示促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡是siRNA干擾survivin基因表達(dá)產(chǎn)生放療增敏效應(yīng)的機(jī)制之一。因此，本實(shí)驗(yàn)為siRNA抑制survivin基因的表達(dá)，從而提高肝癌細(xì)胞凋亡、提高放療敏感性提供了理論依據(jù)，為肝癌基因治療與放療提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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