Notch1蛋白在淋巴瘤組織的表達(dá)及意義

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(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院,山東 青島 266003 1 附屬醫(yī)院血液科; 2 血液學(xué)教研室; 3 附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室)

淋巴瘤是一種異質(zhì)性疾病，根據(jù)組織形態(tài)學(xué)特征，分為霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，是發(fā)病率較高的惡性血液系統(tǒng)腫瘤[1]。隨著分子生物學(xué)、基因組學(xué)的研究進(jìn)展,部分淋巴瘤的發(fā)病機(jī)制已明確，靶向治療的研究及臨床新藥的應(yīng)用使其具有治愈的可能。但仍有部分淋巴瘤易復(fù)發(fā)，難以治愈。研究顯示，信號(hào)通路可能參與淋巴瘤的發(fā)生。Notch信號(hào)通路是一種廣泛且高度保守的信號(hào)通路，該通路參與細(xì)胞的增殖、分化和凋亡[2-3]，在造血細(xì)胞的增殖和分化中起重要作用，其異常時(shí)可導(dǎo)致血液系統(tǒng)惡性腫瘤[4]。本研究檢測(cè)淋巴瘤Notch1蛋白的表達(dá)情況，探討其在淋巴瘤發(fā)生中的作用。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本及其來源

收集2009年10月—2011年11月我院附屬醫(yī)院病理科確診的淋巴瘤標(biāo)本50例，其病歷資料完整。男30例，女20例；年齡6～80歲。診斷符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[5]。其中T細(xì)胞淋巴瘤30例，B細(xì)胞淋巴瘤13例，霍奇金淋巴瘤7例。所有病人病理活檢前均未進(jìn)行抗腫瘤化療或放療。另取15例淋巴結(jié)反應(yīng)增生組織標(biāo)本作為對(duì)照組。所有組織標(biāo)本應(yīng)用40 g/L甲醛固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。

1.2 主要試劑

兔抗人跨膜受體蛋白Notch1抗體、SP免疫組化檢測(cè)試劑盒、DAB染色試劑盒，均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 Notch1蛋白表達(dá)檢測(cè)

采用免疫組織化學(xué)SP染色法。石蠟切片60 ℃烘片，常規(guī)二甲苯脫蠟、乙醇水化，枸櫞酸緩沖液高溫抗原修復(fù)15 min，體積分?jǐn)?shù)0.03的H2O2室溫避光孵育20 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。正常山羊血清封閉抗原，滴加一抗(稀釋度1∶100)，4 ℃過夜,滴加二抗、三抗。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，藍(lán)化、分化，脫水、透明，干燥后中性樹膠封片。用已知子宮內(nèi)膜癌陽性標(biāo)本作陽性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定

根據(jù)文獻(xiàn)[6]方法進(jìn)行染色程度和染色強(qiáng)度判定。高倍鏡下觀察，腫瘤細(xì)胞染色程度：無細(xì)胞染色為陰性，染色細(xì)胞占1%～33%為1分，34%～66%為2分，67%～100%為3分。染色強(qiáng)度：不著色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，深褐色為3分。綜合上述兩項(xiàng)評(píng)分之和判定結(jié)果：≤1分為陰性(-)，2分以上為陽性(+)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 17.0及PPMS 1.5[7]統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)間比較采用四格表卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。

2 結(jié) 果

2.1 淋巴瘤組和對(duì)照組Notch1蛋白表達(dá)比較

Notch1蛋白免疫組化陽性染色主要集中在淋巴瘤細(xì)胞膜和(或)胞漿，部分淋巴瘤細(xì)胞核亦染色，陽性細(xì)胞呈散在分布；對(duì)照組有1例細(xì)胞漿著色。Notch1蛋白在淋巴瘤組和對(duì)照組中的陽性率分別為58.00%(29/50)、6.67%(1/15)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.234,P<0.01)。

2.2 不同類型淋巴瘤組織Notch1蛋白表達(dá)水平比較

Notch1蛋白在T細(xì)胞淋巴瘤組、霍奇金淋巴瘤組及B細(xì)胞淋巴瘤組中的陽性率分別為70.00%(21/30)、71.40%(5/7)，23.80%(3/13)，T細(xì)胞淋巴瘤組和霍奇金淋巴瘤組Notch1蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組，差異有顯著性(χ2=16.052，P<0.05；P=0.004)；而B細(xì)胞淋巴瘤組與對(duì)照組Notch1蛋白表達(dá)水平差異無顯著意義(P=0.311)。3種類型淋巴瘤Notch1蛋白表達(dá)相比較，T細(xì)胞淋巴瘤組高于B細(xì)胞淋巴瘤組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.097，P<0.05)；霍奇金淋巴瘤組與T細(xì)胞淋巴瘤組比較、霍奇金淋巴瘤組和B細(xì)胞淋巴瘤組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.000、0.062)。

2.3 不同年齡、性別淋巴瘤病人Notch1蛋白表達(dá)比較

不同年齡、不同性別淋巴瘤病人Notch1蛋白陽性表達(dá)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同年齡、性別淋巴瘤病人Notch1蛋白表達(dá)比較(例)

3 討 論

Notch蛋白是高度保守的跨膜蛋白，由Notch受體蛋白、Notch配體蛋白、轉(zhuǎn)錄因子CSL(DNA結(jié)合蛋白)和靶分子組成。正常情況下，Notch信號(hào)介入多種細(xì)胞凋亡、增殖和分化等多效性作用，調(diào)節(jié)多細(xì)胞動(dòng)物的形態(tài)發(fā)育和形成[2]。Notch1最早在人類T淋巴母細(xì)胞白血病中被鑒定出來，提示Notch信號(hào)通路與腫瘤相關(guān)[8]。Notch1在多數(shù)惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，但也有少數(shù)實(shí)驗(yàn)顯示其表達(dá)下調(diào)[9]。其原因可能與細(xì)胞特異性有關(guān)。本文研究結(jié)果顯示，淋巴瘤組織中Notch1蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯增高。提示Notch1蛋白高表達(dá)可能與淋巴瘤的發(fā)生有關(guān)。

Notch1在淋巴細(xì)胞發(fā)育的早期階段促進(jìn)共同淋系前體細(xì)胞向T淋巴細(xì)胞發(fā)育，共同淋巴細(xì)胞祖細(xì)胞分化成T淋巴細(xì)胞祖細(xì)胞后，Notch1信號(hào)能促進(jìn)T淋巴細(xì)胞向Tαβ細(xì)胞發(fā)育，抑制其向Tγδ細(xì)胞發(fā)育；同時(shí)還促進(jìn)CD4+、CD8+雙陽性胸腺細(xì)胞向CD4+或CD8+單陽性細(xì)胞分化[10]。Notch1信號(hào)通路能加快細(xì)胞周期，使細(xì)胞處于增殖狀態(tài)，抑制細(xì)胞分化和凋亡[11]。Notch1信號(hào)在T細(xì)胞發(fā)育過程中任意環(huán)節(jié)的紊亂都可能與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)。本文研究結(jié)果顯示，T細(xì)胞淋巴瘤組中Notch1蛋白的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，與JUNDT等[12]研究結(jié)果相似。國外有研究顯示，大多數(shù)腸型T細(xì)胞淋巴瘤存在Notch1基因的點(diǎn)突變[13]；也有研究證實(shí)，超過50%的T淋巴母細(xì)胞淋巴瘤在Notch1的HD和PEST區(qū)域存在突變[14]。表明T細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生可能與Notch1蛋白的表達(dá)升高有關(guān)，Notch1蛋白的高表達(dá)可能與其基因突變有關(guān)。

本文的研究結(jié)果還顯示，霍奇金淋巴瘤組織中Notch1蛋白80%高表達(dá)，提示 Notch1可能在霍奇金淋巴瘤中發(fā)揮一定的作用。這與JUNDT等[12]的研究結(jié)果類似，表明霍奇金淋巴瘤的發(fā)生與Notch1的表達(dá)升高有關(guān)。Notch信號(hào)通路可通過促進(jìn)細(xì)胞生長和抑制細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)霍奇金淋巴瘤的發(fā)生。

Notch受體在B細(xì)胞淋巴瘤中的作用存在分歧。TOHDA等[15]研究結(jié)果表明，彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株(TMD8)存在靶基因Hes-1的表達(dá)，表明Notch信號(hào)被活化，提示在某些B細(xì)胞淋巴瘤中，Notch活化是致癌基因。另有研究結(jié)果顯示，活化的 Notch1抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，起抑癌基因的作用[16]。本研究結(jié)果顯示，B細(xì)胞淋巴瘤組織中Notch1蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較差異無顯著性，與上述文獻(xiàn)結(jié)果不一致，提示Notch1信號(hào)通路在淋巴瘤中的作用是多環(huán)節(jié)的，各個(gè)環(huán)節(jié)所起的作用不同。Notch信號(hào)在B細(xì)胞淋巴瘤發(fā)生中的作用還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，Notch1的異常表達(dá)可能與淋巴瘤的形成有關(guān)，Notch1在不同類型淋巴瘤中的作用可能不同。本文結(jié)果為靶向抑制Notch1信號(hào)通路治療淋巴瘤提供了初步依據(jù)。Notch信號(hào)在淋巴瘤發(fā)生發(fā)展中的確切作用及其機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

[1] 史春雷,王玲,黃梅娟,等.18F-FDG PET/CT在結(jié)外淋巴瘤診治中的臨床應(yīng)用[J]. 齊魯醫(yī)學(xué)雜志, 2010,25(5):394-398.

[2] KARANU F N, MURDOCH B, GALLACHER L, et al. The notch ligand jagged-1 represents a novel growth factor of human hematopoietic stem cells[J]. Journal of Experimental Medicine, 2000,192(9):1365-1372.

[3] DUMORTIER A, WILSON A, MACDONALD H R, et al. Paradigms of notch signaling in mammals[J]. International Journal of Hematology, 2005,82(4):277-284.

[4] CHIARAMONTE R, BASILE A, TASSI E, et al. A wide role for NOTCH1 signaling in acute leukemia[J]. Cancer Letters, 2005, 219(1):113-120.

[5] 張之南,沈悌. 血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)[M]. 3版. 北京:科學(xué)出版社, 2007:217-228.

[6] GAO J, LIU J, FAN D, et al. Up-regulated expression of Notch1 and Jagged1 in human colon adenocarcinoma[J]. Pathologie Biologie, 2011,59(6):298-302.

[7] 周曉彬. 醫(yī)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件 PPMS 1.5 在醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中的應(yīng)用價(jià)值[J]. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2011,47(6):504-506.

[8] ELLISEN L W, BIRD J, WEST D C, et al. TAN-1, the human homolog of the Drosophila notch gene, is broken by chromosomal translocations in T lymphoblastic neoplasms[J]. Cell, 1991,66(4):649-661.

[9] 王敏,李錦添,曾益新,等. Notch1,P21WAFl和Involucrin在鼻咽癌組織中的表達(dá)及意義[J]. 癌癥, 2005,24(10):1230-1234.

[10] DORSCH M, ZHENG GANG, YOWE D, et al. Ectopic expression of Delta4 impairs hematopoietic development and leads to lymphoproliferative disease[J]. Blood, 2002,100(6):2046-2055.

[11] CULLION K, DRAHEIM K M, HERMANCE N, et al. Targeting the notch1 and mTOR pathways in a mouse T-ALL model[J]. Blood, 2009,113(24):6172-6181.

[12] JUNDT F, ANAGNOSTOPOULOS I, F?RSTER R, et al. Activated notch1 signaling promotes tumor cell proliferation and survival in hodgkin and anaplastic large cell lymphoma[J]. Blood, 2002,99(9):3398-3403.

[14] WENG A P, FERRANDO A A, LEE W, et al. Activating mutations of NOTCH1 in human T cell acute lymphoblastic leukemia[J]. Science, 2004,306(5694):269-271.

[15] TOHDA S, SATO T, KOGOSHI H, et al. Establishment of a novel B-cell lymphoma cell line with suppressed growth by gamma-secretase inhibitors[J]. Leukemia Research, 2006,30(11):1385-1390.

[16] ZWEIDLER-MCKAY P A, HE YIPING, XU LANWEI, et al. Notch signaling is a potent inducer of growth arrest and apoptosis in a wide range of B-cell malignancies[J]. Blood, 2005,106(12):3898-3906.