VEGF-siRNA誘導(dǎo) MCF-7細(xì)胞凋亡及其機(jī)制

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(濱州醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，山東 煙臺(tái) 264003)

血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是目前發(fā)現(xiàn)的最重要的腫瘤血管生成促進(jìn)因子。VEGF可通過旁分泌機(jī)制刺激腫瘤細(xì)胞血管生成，進(jìn)而加速腫瘤細(xì)胞的增殖。新的研究結(jié)果也顯示，除了旁分泌作用機(jī)制外，VEGF還可通過自分泌機(jī)制抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。survivin是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的抗凋亡因子，它通過抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入增殖期兩方面的作用對(duì)抗細(xì)胞凋亡。近幾年來，關(guān)于VEGF 與survivin相關(guān)性的研究逐漸展開。但是，應(yīng)用RNA干擾(RNAi)技術(shù)沉默乳癌細(xì)胞VEGF表達(dá)后survivin基因是否相應(yīng)下調(diào),國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本文研究在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用RNAi技術(shù)下調(diào)人乳癌MCF-7細(xì)胞VEGF表達(dá)后,采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，分別從基因和蛋白水平檢測survivin在轉(zhuǎn)染前后的變化，以探討靶向VEGF的siRNA下調(diào)VEGF表達(dá)后引起的細(xì)胞凋亡狀態(tài)的改變，以及細(xì)胞凋亡與凋亡相關(guān)基因survivin的關(guān)系，從分子水平探討下調(diào)VEGF后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制，為腫瘤的分子治療尋求新方向。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人乳癌MCF-7細(xì)胞株，由青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室凍存。DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清購自民海生物科技有限公司。AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司；PCR檢測試劑盒購自TaKaRa公司，Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自貝博公司；免疫組化檢測試劑盒SP-9001及DAB顯色試劑盒購自北京中杉試劑公司；兔抗人survivin單克隆抗體為Thermo公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) MCF-7細(xì)胞在含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清、青霉素100 kU/L、鏈霉素100 mg/L的DMEM培養(yǎng)基中貼壁生長后，置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)。

1.2.2siRNA設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)文獻(xiàn)[3]設(shè)計(jì)引物，VEGF siRNA序列：正義鏈5′-GGAGUACC-CUGAUGAGAUCUU-3′，反義鏈5′-GAUCUCAU-CAGGGUACUCCUU-3′；陰性對(duì)照siRNASCR(sc-ramble siRNA)序列：正義鏈5′-UUCUCCGAACG-UGUCACGUTT-3′，反義鏈5′-ACGUGACACGUU-CGGAGAATT-3′。兩序列均行BLAST比對(duì)分析以排除其同源性，并對(duì)VEGF siRNA正義鏈末端行甲基化修飾，以增強(qiáng)其穩(wěn)定性。所用引物均由大連寶生物公司合成，所有序列均由上海吉瑪生物技術(shù)有限公司化學(xué)合成。

1.2.3siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞及分組 選取生長狀態(tài)良好、貼壁生長至70%～80%融合的細(xì)胞種板。按每孔1.5×105個(gè)細(xì)胞數(shù)接種于6孔培養(yǎng)板，體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d改用不含抗生素、僅含血清的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞融合度達(dá)30%～50%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)，棄去細(xì)胞孔板中舊培養(yǎng)液,按LipofectamineTM2000使用說明方法進(jìn)行操作，首先用不含抗生素和血清的DMEM培養(yǎng)基將siRNA (50 pmol)和LipofectamineTM2000 (2.5 μL)分別稀釋至250 μL(siRNA的終濃度為100 nmol/L)，室溫孵育5 min后將兩者緩慢混勻，再經(jīng)室溫孵育20 min后加到細(xì)胞板孔中，細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2、37 ℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 h后加入常規(guī)含血清培養(yǎng)基正常培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為6組?？瞻讓?duì)照組：實(shí)驗(yàn)時(shí)棄正常培養(yǎng)基，只加無血清無抗生素的培養(yǎng)基;脂質(zhì)體對(duì)照組：不加siRNA，只加入空脂質(zhì)體LipofectamineTM2000;3個(gè)濃度siRNA組：siRNA終濃度分別為50、100、200 nmol/L;陰性對(duì)照(siRNASCR)組：siRNASCR終濃度為100 nmol/L。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 轉(zhuǎn)染VEGF siRNA 24 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況。常規(guī)消化收集細(xì)胞，D-Hanks液輕柔沖洗細(xì)胞兩次，然后以400 μL Binding Buffer懸浮細(xì)胞，密度大約為1×108/L，然后加入5 μL Annexin V-FITC，輕柔混勻，2～8 ℃避光孵育15 min，孵育結(jié)束后加入10 μL的PI，輕柔混勻，2～8 ℃避光孵育5 min，1 h內(nèi)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5半定量RT-PCR檢測survivin基因mRNA表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染VEGF siRNA 24 h后，按照Trizol試劑盒操作說明提取細(xì)胞總RNA。將所提取總RNA 1 μg行20 μL體系逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，具體步驟按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明的方法進(jìn)行。取cDNA行后續(xù)25 μL體系PCR反應(yīng)，以β-actin為內(nèi)參，其中survivin引物序列分別為：上游引物5′-GAGCTG-CAGGTTCCTTATC-3′,下游引物5′-ACAGCATC-GAGCCAAGTCAT-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物為434 bp；β-actin的引物序列為：上游引物5′-GTGACAGCAGTCGG-TTGG-3′,下游引物5′-AAAACTTACTACTCGG-AAGG-3′，產(chǎn)物長度298 bp。survivin PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次；72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后觀察拍照，然后應(yīng)用天能分析軟件對(duì)各條帶進(jìn)行吸光度(A)掃描，以各組survivin mRNA RT-PCR產(chǎn)物與其對(duì)應(yīng)內(nèi)參β-acting的A值之比表示survivin基因mRNA表達(dá)水平。

1.2.6免疫組化檢測MCF-7細(xì)胞survivin蛋白的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，接種于鋪好蓋玻片的24孔板，正常培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，按照1.2.3所述方法進(jìn)行VEGF siRNA轉(zhuǎn)染，48 h后棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗3次，每次5 min，然后加40 g/L的多聚甲醛固定(4 ℃,30 min)，固定結(jié)束后吸干多聚甲醛，PBS沖洗3次，每次5 min。然后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,按照試劑盒的說明書操作。DAB顯色，操作嚴(yán)格按照DAB試劑盒說明書進(jìn)行，顯微鏡下觀察顯色情況，控制顯色時(shí)間。顯色結(jié)束，自來水沖洗終止反應(yīng),梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。survivin陽性染色呈棕黃色顆粒狀，定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。在每張玻片上隨機(jī)抽取3個(gè)視野，應(yīng)用VIDAS圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行吸光度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞凋亡情況比較

轉(zhuǎn)染24 h以后，與空白對(duì)照組相比較，3個(gè)濃度siRNA組MCF-7細(xì)胞早、晚期凋亡率均增加，差異有顯著意義(F=35.81、30.12，q=6.08～56.53，P<0.05)；siRNASCR組、脂質(zhì)體對(duì)照組早、晚期凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2 各組survivin mRNA表達(dá)比較

轉(zhuǎn)染VEGF siRNA后24 h，3個(gè)濃度siRNA組survivin mRNA表達(dá)均下調(diào)，差異有顯著性(F=21.59，q=11.56～253.20，P<0.05、0.01)；其中50 nmol/L siRNA組survivin mRNA表達(dá)高于100 nmol/L siRNA組和200 nmol/L siRNA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=8.75～35.40，P<0.05)；100 nmol/L siRNA組和200 nmol/L siRNA組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。siRNASCR組、脂質(zhì)體對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1、表2。

2.3 各組survivin蛋白表達(dá)水平比較

與空白對(duì)照組比較，3個(gè)劑量siRNA組survivin蛋白表達(dá)水平均降低(F=35.64,q=25.72～273.20,P<0.05、0.01)；其中50 nmol/L siRNA組survivin 蛋白表達(dá)明顯高于100、200 nmol/L siRNA組(q=69.80～358.70，P<0.01)，100 nmol/L siRNA組和200 nmol/L siRNA組之間差異無顯著性(P>0.05)；siRNASCR組、脂質(zhì)體對(duì)照組與空白對(duì)照組之間比較差異無顯著意義(P>0.05)。見表2。

表1 各組細(xì)胞凋亡情況比較

①M(fèi)arker；②無酶水；③50 nmol/L VEGF siRNA組；④100 nmol/L VEGF siRNA組；⑤200 nmol/L VEGF siRNA組；⑥siRNASCR組；⑦脂質(zhì)體對(duì)照組；⑧空白對(duì)照組。

表2 各組survivin mRNA和蛋白表達(dá)比較

3 討 論

VEGF是目前研究最多的血管生成促進(jìn)因子，在正常成熟組織中較少表達(dá)，但在腫瘤組織中高度表達(dá)。已有文獻(xiàn)報(bào)道，VEGF在諸如乳癌、膀胱癌及血液系腫瘤如白血病、淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤等多種惡性腫瘤組織中均呈現(xiàn)高表達(dá)[1-3]。VEGF和位于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞上的特異性酪氨酸蛋白激酶受體(VEGFR)結(jié)合后，能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和分化，增強(qiáng)血管通透性，加速腫瘤新生血管的形成。FERRER等[4]研究顯示，在前列腺癌細(xì)胞中，除了高表達(dá)VEGF外，VEGF的受體 FLT-1 和FLK-1 都有表達(dá)。MEISTER等[5]研究顯示，人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株和神經(jīng)母細(xì)胞瘤原位癌均有VEGF和受體FLK-1表達(dá)。其結(jié)果提示腫瘤細(xì)胞自身分泌的VEGF可以作用于細(xì)胞本身上的受體，通過一定的機(jī)制來對(duì)抗腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。其機(jī)制可能是：VEGF與腫瘤細(xì)胞上的受體結(jié)合后,激活了某種信號(hào)途徑，使一些原癌基因激活、抑癌基因失活,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)抗凋亡作用。

本文研究結(jié)果顯示，靶向VEGF的siRNA轉(zhuǎn)染入MCF-7細(xì)胞后能夠引起細(xì)胞凋亡率的增加，并且有一定的劑量依賴性。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果已經(jīng)證實(shí)，靶向VEGF的siRNA轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后首先沉默VEGF的表達(dá)[6]，故可認(rèn)為是VEGF表達(dá)的下調(diào)引起細(xì)胞凋亡率的增加，證實(shí)人乳癌MCF-7細(xì)胞中存在VEGF調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡的自分泌機(jī)制。

為了進(jìn)一步探討VEGF下調(diào)引起MCF-7細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR和細(xì)胞免疫組化技術(shù)，分別檢測了VEGF siRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞以后，細(xì)胞凋亡相關(guān)基因survivin mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化，以期在分子水平上尋找靶向VEGF的siRNA下調(diào)VEGF后引起MCF-7細(xì)胞凋亡的原因。 survivin又名生存素或存活素，是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的抗凋亡因子，正常情況下，發(fā)育成熟的組織(胸腺和生殖腺除外)中不表達(dá)survivin，僅在胚胎組織中有survivin的表達(dá)[7]。但是在包括乳癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤組織中都檢測到survivin異常高表達(dá)。TANAKA等[8]研究結(jié)果顯示，乳癌組織中survivin陽性表達(dá)率高達(dá)70.7%，但癌旁組織中陰性表達(dá)，提示survivin可能參與了乳癌的發(fā)生發(fā)展。survivin對(duì)抗細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制是：①survivin是凋亡效應(yīng)性蛋白酶caspase3和caspase7的直接抑制劑; ②survivin與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白CDK4形成 survivin/CDK4復(fù)合物，阻斷細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路[9];③survivin與紡錘體纖維結(jié)合，間接抑制凋亡酶caspase對(duì)紡錘體的水解作用。

已有研究結(jié)果顯示，血管內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF對(duì)survivin的表達(dá)具有正向調(diào)控作用，即二者之間存在著正相關(guān)關(guān)系，VEGF能夠?qū)urvivin的表達(dá)產(chǎn)生增強(qiáng)和誘導(dǎo)作用，而survivin的表達(dá)上調(diào)則是內(nèi)皮細(xì)胞在血管生成過程中維持生存活力的必要條件[10]。ZHOU 等[11]研究顯示，人卵巢癌中下調(diào)VEGF的表達(dá)可使癌細(xì)胞中survivin的表達(dá)下調(diào)。但是應(yīng)用RNAi的方法下調(diào)VEGF后能否引起survivin表達(dá)相應(yīng)下調(diào)尚未見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，各濃度siRNA轉(zhuǎn)染組survivin mRNA及蛋白表達(dá)水平均較空白對(duì)照組降低，證實(shí)應(yīng)用RNAi下調(diào)VEGF后survivin的表達(dá)隨之下調(diào)，并且達(dá)到一定干擾濃度之后會(huì)顯著下調(diào)(100 nmol/L siRNA組)。推測在VEGF的信號(hào)傳導(dǎo)通路中，survivin可能是其下游分子，沉默VEGF所致的細(xì)胞凋亡在一定程度上是通過下調(diào)survivin表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，人乳癌MCF-7細(xì)胞存在VEGF及其受體的自分泌環(huán)路。靶向VEGF基因的siRNA轉(zhuǎn)染MCF-7 后可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其分子機(jī)制與凋亡相關(guān)基因survivin表達(dá)有關(guān)。因此，以VEGF為靶點(diǎn)，應(yīng)用 RNAi治療乳癌具有雙重效應(yīng)，一方面通過抑制VEGF的自分泌途徑，以達(dá)到誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的目的；另一方面通過抑制VEGF的旁分泌途徑，降低了腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖分化，通過減少腫瘤組織新生血管的生成來對(duì)抗腫瘤的發(fā)展。為腫瘤基因治療提供了新的依據(jù)。

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