土壤木霉菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測體系的建立及應(yīng)用

魏 巍，許艷麗，朱 琳，董 楠，韓曉增，Li S

(1. 中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所中國科學(xué)院黑土區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150081;2. 東京大學(xué)生物工學(xué)專攻，日本東京1138657;3. 美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究局作物遺傳研究中心，美國Stoneville 38776)

0 引 言

木霉菌屬(Trichoderma spp. )是土壤中主要的真菌類群之一，也是最具代表性的生防真菌類群［1］。其屬內(nèi)多數(shù)菌種具有對作物真菌病害的抑制性作用。僅以鐮孢菌屬引起的作物真菌病害為例，已報(bào)道的多種木霉菌屬真菌可以對作物的鐮孢菌根腐病、赤霉病、冠腐病、莖腐病、萎蔫病和枯萎病等鐮孢菌病害進(jìn)行防治［2－6］。因此，土壤中該真菌屬種群的研究在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要意義。長期以來，木霉菌種群研究應(yīng)用的稀釋平板法所具有的局限性使自然條件下土壤木霉菌種群密度的研究無法全面及準(zhǔn)確地進(jìn)行［1，7］。近年來，實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Real-Time QPCR)技術(shù)在微生物生態(tài)學(xué)研究中得到越來越廣泛地應(yīng)用，為環(huán)境樣品中目的木霉菌檢測提供了全新方法，即通過檢測木霉菌靶序列PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號強(qiáng)度達(dá)到實(shí)時(shí)解析木霉菌種群密度的目的［8－9］。然而，關(guān)于黑土土壤木霉菌屬種群密度的實(shí)時(shí)熒光定量檢測體系建立及應(yīng)用的研究尚未見報(bào)道。

參考國際木霉與肉座菌屬分類委員會(huì)(International Subcommission on Trichoderma and Hypocrea Taxonomy)的基因序列在線數(shù)據(jù)庫TrichoBLAST 中公布的ITS 序列信息(http://isth. info/tools/blast/show_ all_seq. php)，設(shè)計(jì)并應(yīng)用了木霉菌屬實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測的特異性引物，對黑土大豆田3 種施肥措施下土壤木霉菌屬基因組DNA 含量進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測，旨在建立黑土大豆田土壤木霉菌屬種群密度的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 定量方法。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2011 年采集土壤樣品于中國科學(xué)院海倫農(nóng)業(yè)生態(tài)試驗(yàn)站(中心位置為47°26'N，126°38'E)長期施肥定位試驗(yàn)區(qū)。海倫試驗(yàn)區(qū)開墾歷史為100 a 左右，開墾前為草甸草原植被，土壤類型為典型的黑土。試驗(yàn)設(shè)置為1993 年設(shè)立的3 個(gè)施肥處理:無肥處理(no fertilization，NF)、化肥處理(chemical fertilization applied with nitrogen and phosphorus，NP)和化肥配施有機(jī)肥處理(chemical and organic fertilization applied with nitrogen，phosphorus and pig manure，NPM)。NP 和NPM 措施的施肥量為P2O582.44 kg·hm－2、N 32.26 kg·hm－2、有機(jī)肥腐熟豬糞肥15 000 kg·hm－2［10－11］。作物種植方式為輪作(小麥－玉米－大豆)。在大豆生育期的苗期(6 月10 日)，按五點(diǎn)取樣法應(yīng)用土鉆采集3 種施肥措施土壤非根際土樣。各處理去除0～5 cm 表土以避免其受空氣的影響。采集5 cm～20 cm 深度的土壤樣品，均勻混合后置于無菌封口袋包內(nèi)，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室過2 mm 土壤篩后，于4 ℃保存［11］。

1.2 引物設(shè)計(jì)及檢測

參照木霉菌屬基因組序列在線數(shù)據(jù)庫TrichoBLAST，應(yīng)用MEGA 5.0 生物軟件比對并設(shè)計(jì)了木霉菌屬真菌特異性引物DG 和DT，并由上海生物工程有限公司合成。引物的序列:DG:5'－CTG GCA TCG ATG AAG AAC G－3'和DT:5'－ATG CGA GTG TGC AAA CTA CTG－3'。引物的特異性檢測應(yīng)用本課題組保存的木霉菌和其它真菌菌株，包括桔綠木霉T. citrinoviride、擬康氏木霉T. pseudokoningii、刺孢木霉T. asperellum、黃綠木霉T. aureoviride、綠色木霉T. viride 和綠木霉T. virens 各2 株，哈茨木霉T. harzianum 3株，鐮孢菌Fusarium spp.4 株以及曲霉菌Aspergillus spp. ，葡萄孢菌Botrytis spp. ，毛霉菌Mucor spp. 以及青霉菌Penicillium spp. 各1 株。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 研究

使用美國Omega 公司的Soil DNA Kit 提取土壤微生物基因組總DNA，取1 g 土壤樣品按照操作手冊進(jìn)行提取。同樣使用Omega 公司的Fungal DNA Kit 進(jìn)行該實(shí)時(shí)熒光定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)品——綠木霉Trichoderma virens SCC－3 基因組DNA 的提取。取200 mg 經(jīng)單孢分離及形態(tài)學(xué)鑒定的綠木霉菌株SCC－3 按照操作手冊進(jìn)行提取。DNA 的純化均應(yīng)用美國Promega 公司的Wizard Gel and PCR Clean－Up System，并用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢查土壤和純菌菌株基因組DNA 的大小和濃度。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)體系應(yīng)用TAKARA 公司的SYBR? Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系為25 μl，包括SYBR? Premix Ex Taq12.5 μl，引物DG 和DT (10 μM)各1 μl，DNA 模板1 μl (20 ng)，5%BSA 溶液1 μl 以及滅菌蒸餾水8.5 μl。PCR 反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 s;40 個(gè)循環(huán)的反應(yīng)過程，包括94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，并收集熒光信號;最后72 ℃5 min。于65 ℃～95 ℃之間每隔0.2 ℃收集熒光信號1 s 用于熔點(diǎn)曲線分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用R 程序2.12.2 (http://www. r－project. org)和MJ Opticon Monitor TM 3.1 實(shí)時(shí)熒光定量分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)和定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物特異性檢測

引物PCR 擴(kuò)增結(jié)果顯示，15 株木霉菌菌株分別有1 條約250 bp 的特異性擴(kuò)增帶，而其它應(yīng)用土壤常見真菌為參照的陰性對照菌株以及空白對照均無擴(kuò)增，見圖1，說明所設(shè)計(jì)的引物具有良好的木霉菌屬真菌特異性。

圖1 木霉菌屬real－time PCR 引物的特異性檢測Fig.1 The specificity detection of the real－time PCR primers for Trichoderma spp.

2.2 土壤木霉菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測體系的建立

以哈茨木霉 (T. harzimum)菌株基因組DNA 作為標(biāo)準(zhǔn)品，測定該標(biāo)準(zhǔn)品DNA 溶液濃度為102.2 ng·ul－1。以原液100～1045 個(gè)濃度梯度的DNA 溶液作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品5 個(gè)濃度梯度的模板反應(yīng)循環(huán)閾值(Ct 值)計(jì)算并繪制反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2。該標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為－0.282 9，相關(guān)系數(shù)R2=0.993，計(jì)算其擴(kuò)增效率E=92%。

圖2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve Real－Time QPCR

測定并繪制各濃度稀釋梯度的標(biāo)準(zhǔn)品及樣品在實(shí)時(shí)熒光定量過程中的熔點(diǎn)曲線，見圖3。其中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 體系的熔點(diǎn)曲線信號峰值單一，且標(biāo)準(zhǔn)品及樣品熔點(diǎn)溫度相同(89 ±0.4 ℃)。該結(jié)果同樣表明擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物特異性良好且無引物二聚體影響。

圖3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 熔點(diǎn)曲線Fig.3 Melting curve of Real－Time QPCR

綜合上述引物檢測、標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔點(diǎn)曲線結(jié)果，可以確定建立的土壤木霉菌屬真菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測體系及反應(yīng)條件合理可靠。

2.3 不同施肥措施下土壤木霉菌基因組DNA 含量

利用該實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測體系對大豆田3 種長期施肥措施土壤木霉菌基因組DNA 含量進(jìn)行定量檢測。應(yīng)用BioRad 公司的的MJ Opticon Monitor 3.1 軟件結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線及C (t)值結(jié)果，計(jì)算出3 種土壤樣品中木霉菌屬基因組DNA 含量，見圖4。在大豆的苗期，NPM 措施下每克干土中木霉菌DNA 含量為1.2 ng，顯著高于NF 和NP 措施(P ＜0.05)。其次為NP 措施0.8 ng·g－1干土。而無肥措施土壤木霉菌DNA含量為0.4 ng。該結(jié)果說明NP 以及NPM 措施均可以增加大豆田土壤木霉菌基因組DNA 含量，且NPM 措施效果更為明顯。

圖4 3 種施肥措施土壤木霉菌屬基因組DNA 含量Fig.4 The mass of genomic DNA of Trichoderma spp. in soil from three fertilization managements

3 結(jié)論與討論

土壤微生物以及木霉菌菌株基因組DNA 的提取均使用DNA 提取試劑盒進(jìn)行。該試劑盒具有操作簡便，提取效率高(每克土壤提取微生物基因組DNA 含量超于2 000 ng)等特點(diǎn)，因此可以確保實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測體系的規(guī)范性、可重復(fù)性和靈敏性。實(shí)時(shí)熒光定量體系中應(yīng)用的SYBR ? Premix Ex TaqTM試劑盒確保了每個(gè)實(shí)時(shí)定量PCR 反應(yīng)管中的一致的反應(yīng)體系，增加了試驗(yàn)的重復(fù)性以及可信性，同時(shí)再體系中加入的5%BSA 溶液可以有效地消除黑土土壤中高濃度腐殖酸對PCR 反應(yīng)的抑制，提高了檢測的靈敏性。反應(yīng)中應(yīng)用的木霉菌屬特異性引物的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物中無非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體出現(xiàn)，顯示出良好的木霉菌屬特異性。應(yīng)用該引物進(jìn)行的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)熔點(diǎn)曲線中峰型單一，無源于非特異性和引物二聚體的雜峰出現(xiàn)。同時(shí)，熒光定量反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率、相似性系數(shù)以及由此計(jì)算的反應(yīng)效率也達(dá)到實(shí)時(shí)熒光定量檢測的理想水平。

應(yīng)用該引物建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)體系成功定量了不同施肥措施土壤中木霉菌基因組DNA 的含量。土壤木霉菌種群密度的研究一直借助于稀釋平板法等傳統(tǒng)研究方法［1，14］。雖然傳統(tǒng)平板法操作簡單，易成功［7］，但由于其依賴非天然的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)生長，而培養(yǎng)基成份可以影響所得木霉菌菌落的多樣性水平，從而無法全面反映環(huán)境樣品中木霉菌的自然生長狀況，得到準(zhǔn)確有效的結(jié)果。因此，當(dāng)進(jìn)行較大量樣品的木霉菌屬真菌種群密度研究時(shí)，傳統(tǒng)的稀釋平板研究方法勢必成為一個(gè)潛在的限制因子。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法可以準(zhǔn)確反映出土壤木霉菌基因組總DNA 的含量，而由于土壤木霉菌屬真菌種群密度與該屬基因組DNA 質(zhì)量呈正向相關(guān)，因此可以通過比較不同土壤樣品中木霉菌屬真菌基因組DNA質(zhì)量間的差異來評估不同土壤環(huán)境中木霉菌屬真菌種群密度［15］。該方法由于避免了依靠合成培養(yǎng)基的培養(yǎng)過程，所以克服了上述傳統(tǒng)平板法中營養(yǎng)限制帶來的研究局限性。同時(shí)，由于實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)時(shí)間短，因此其還具有快捷、實(shí)時(shí)及可重復(fù)等優(yōu)勢。因此，該木霉菌實(shí)時(shí)熒光定量檢測體系的建立為土壤環(huán)境樣品中木霉菌屬種群密度的相關(guān)研究提供了有效的方法。

在大豆生育期的苗期，黑土區(qū)3 種長期施肥措施土壤木霉菌屬真菌基因組DNA 在每克干土中的含量(Q)的順序?yàn)镼NF ＜QNP ＜QNPM，且NPM 措施的優(yōu)勢顯著。根據(jù)已有研究結(jié)果，黑土農(nóng)田土壤在長期不施用肥料的情況下，土壤肥力隨著有機(jī)質(zhì)含量的下降而顯著地降低;長期單一施用氮，磷等化肥肥料時(shí)，黑土土壤有機(jī)碳和氮庫保持穩(wěn)定或小幅波動(dòng)，但土壤肥力高于長期無肥措施;當(dāng)長期將氮，磷化肥和有機(jī)肥配合施用時(shí)，黑土土壤有機(jī)質(zhì)含量將顯著地提高，土壤有機(jī)碳和氮庫得以積累，從而使土壤肥力遠(yuǎn)高于無施肥以及單施化學(xué)肥措施［10］。由此可見，對土壤長期施用化肥和有機(jī)肥可以增加大豆田土壤有機(jī)質(zhì)養(yǎng)分的含量，提高土壤肥力，為土壤微生物生長繁育的提供了充足的營養(yǎng)條件［16－17］。而作為一種重要的腐生真菌，土壤木霉菌的生長繁殖需要大量有機(jī)質(zhì)養(yǎng)分，所以土壤木霉菌種群密度與土壤有機(jī)質(zhì)含量之間可能存在一定的正向相關(guān)關(guān)系，從而導(dǎo)致大豆田土壤木霉菌屬真菌種群密度在長期NPM 作用下達(dá)到了較高的水平。

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