注射用賴氨匹林細菌內(nèi)毒素檢查法的研究*

凌 真

(揚州市藥品檢驗所，揚州 225009)

賴氨匹林(lysine acetylsalicylate)是阿司匹林與賴氨酸的復(fù)鹽，作為阿司匹林的衍生物，是由法國Egic制藥公司于上世紀70 年代首推上市的一種新型解熱鎮(zhèn)痛藥;其水溶性好，pH 值為5 ～6，適用于肌肉和靜脈給藥，起效快，有更強的鎮(zhèn)痛解熱作用。該藥對造血機制、肝腎功能均無影響，同時含有人體必需的賴氨酸，臨床用于小兒解熱鎮(zhèn)痛及癌癥患者二、三級止痛，效果良好，應(yīng)用廣泛。

注射用賴氨匹林在現(xiàn)行的檢驗標準中，安全性檢查的項目各有不同，分為家兔法和細菌內(nèi)毒素檢查法，其中細菌內(nèi)毒素檢查法的限值也不盡相同。從動物福利的角度出發(fā)，本文對注射用賴氨匹林的細菌內(nèi)毒素檢查法進行了研究，為更好地評價該藥的質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 DC 3A 型干式恒溫器(南京三愛斯技術(shù)開發(fā)有限公司);SW-CJ-1A 標準型潔凈工件臺;ZH-2型自動旋渦混合器(天津藥典標準儀器廠);微量移液器(Gilson 法國)。試驗所用玻璃器皿均250 ℃干烤30 min 以上，用以除去細菌內(nèi)毒素。

1.2 材料 鱟試劑(靈敏度:0.25 Eu/ml，湛江安度斯生物有限公司，批號1206202);鱟試劑(靈敏度:0.25 Eu/ml，福州新北生化工業(yè)有限公司，批號12110112);細菌內(nèi)毒素工作標準品(160 Eu/支，中國藥品生物制品檢定研究院，批號150601 -201174);細菌內(nèi)毒素檢查用水(5 m1，福州新北生化工業(yè)有限公司，批號11010405);注射用賴氨匹林(0.9 g/支，揚州一洋制藥有限公司，批號120528、120415、120410)

2 方法與結(jié)果

2.1 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗 按照《中國藥典》2010年版二部附錄XI E 細菌內(nèi)毒素檢查法［1］規(guī)定，對兩個廠家的鱟試劑進行靈敏度復(fù)核，結(jié)果見表1。

依據(jù)公式λc=Antilg(ΣX/4)，兩批鱟試劑的λc 均在0.5 ～2.0 λ (包括0.5 λ 和2.0 λ)，所以兩批鱟試劑均可用于細菌內(nèi)毒素檢查。

2.2 L 的確定［2］成人體重為60 kg，臨床使用劑量為1.8 g/d，M=30 mg/kg·h-1，L=K/M，根據(jù)《中國藥典》2010 年版附錄細菌內(nèi)毒素檢查法要求，K = 5 Eu/kg·h-1，則成人的L =0.167 Eu/mg，根據(jù)熱原檢查法，配制藥液濃度為60 mg/ml，注射劑量為1 ml/kg，則L=K/(60 mg/ml·1 ml/kg)=0.0833 Eu/mg。因為臨床使用，安全要求更高，選取L=0.08 Eu/mg。

2.3 MVC 的計算 MVC=λ/L，其中L 為注射用賴氨匹林的細菌內(nèi)毒素限值0.08 Eu/mg，λ 為鱟試劑的靈敏度。目前市售鱟試劑靈敏度λ 通常為0. 5、0. 25、0.125、0.06 和0.03 Eu/ml，實驗時，再向前增設(shè)一個濃度，則注射用賴氨匹林的對應(yīng)最小有效稀釋濃度分別為:12.5、6.25、3.12、1.56、0.78 和0.39 mg/ml。

表1 鱟試劑靈敏度復(fù)核

2.4 預(yù)試驗 供試品(NPC)系列:用細菌內(nèi)毒素檢查用水將注射用賴氨匹林稀釋成12. 5、6. 25、3. 12、1.56、0.78 和0.39 mg/ml 系列濃度，制成系列濃度溶液記為NPC。供試品陽性對照(PPC)系列:將供試品稀釋成上述相同的系列濃度，在每一濃度供試品中都加入細菌內(nèi)毒素標準溶液，使每一濃度供試品中均含有2 λ 濃度的內(nèi)毒素，記此系列濃度為PPC。取靈敏度為0.25 Eu/ml 的兩個廠家的鱟試劑，分別與上述NPC 系列和PPC 系列進行反應(yīng)，每一濃度重復(fù)2 管，并設(shè)陽性(PC)和陰性(NC)對照各1 管，結(jié)果見表2。根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果可初步確定該樣品在稀釋至3. 12 mg/ml 及以下濃度時，對不同廠家的鱟試劑不產(chǎn)生干擾。

表2 注射用賴氨匹林干擾試驗預(yù)試驗

2.5 正式干擾試驗 供試品干擾試驗:用細菌內(nèi)毒素檢查用水將3 批樣品稀釋至3.12 mg/ml 作為供試品溶液，再用上述溶液及細菌內(nèi)毒素檢查用水將細菌內(nèi)毒素工作品配制成0.5、0.25、0.125 和0.06 Eu/ml 濃度的系列內(nèi)毒素溶液。每一內(nèi)毒素濃度平行做4 管，并分別做2 管陰性對照，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，Es 均在0.5 ～2.0 λ(包括0.5 λ 和2.0 λ)范圍內(nèi)，Et 亦均在0.5 ～2.0 Es(包括0.5 Es 和2.0 Es)，確認供試品在稀釋至3.12 mg/ml 濃度后，對不同廠家生產(chǎn)的鱟試劑無干擾。

2.6 供試品細菌內(nèi)毒素檢查與熱原檢查結(jié)果比較按《中國藥典》2010 年版二部附錄ⅪE 中細菌內(nèi)毒素檢查法，用細菌內(nèi)毒素檢查用水將10 批注射用賴氨匹林稀釋至3.12 mg/ml 濃度時，用兩個廠家的鱟試劑(λ=0.25 Eu/ml)進行檢查，結(jié)果全部呈陰性，與熱原檢查結(jié)果一致。

表3 注射用賴氨匹林正式干擾試驗結(jié)果

3 討論

3.1 預(yù)試驗的目的是評價樣品濃度對鱟試劑與內(nèi)毒素凝集反應(yīng)的干擾程度及干擾性質(zhì)，以便篩選出對檢查無干擾的樣品濃度限值。從表2 和表3 可以看出，當樣品稀釋濃度高于3.12 mg/ml 時，用0.25 Eu/ml 的鱟試劑進行檢測，PPC 系列樣品不發(fā)生凝固反應(yīng)。說明樣品濃度高于3.12 mg/ml 時，對細菌內(nèi)毒素檢查試驗的結(jié)果有干擾作用，這可能和樣品本身成分及輔料或雜質(zhì)成分有關(guān)，其成因有待進一步研究。

3.2 不同廠家生產(chǎn)的鱟試劑，其實際靈敏度與標示靈敏度略有差異，正式干擾試驗采用兩個廠家的鱟試劑與稀釋至3.12 mg/ml 的供試液作用，結(jié)果Es 在0.5 ～2.0 λ(包括0.5 λ 和2.0 λ )，且Et 在0.5 ～2.0 Es(包括0.5 Es 和2.0 Es)之間，按照《中國藥典》2010 版附錄中干擾試驗的判斷方法，確認供試品在該濃度下無干擾作用。

3.3 鱟試劑法與家兔熱原法相比，操作簡便，靈敏度高，符合動物福利的要求，可以用細菌內(nèi)毒素檢查法代替注射用賴氨匹林的兔熱原檢查法。

注射用賴氨匹林是國家基本藥物，臨床使用良好，控制藥品質(zhì)量非常必要。對于安全性評價的熱原法，具有檢驗成本高，個體差異大等不利因素，可以考慮用細菌內(nèi)毒素檢查法代替熱原法，便于對產(chǎn)品質(zhì)量進行評價。

1 中國藥典［S］.二部.2010:附錄99 -102

2 馮建新.注射用賴氨匹林細菌內(nèi)毒素的檢測［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2000，20(4):252