重組人血管內(nèi)皮抑素對(duì)人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞RPMI 8226 增殖和相關(guān)蛋白表達(dá)的影響*

夏 盈， 鄭 冬△， 張瓏涓， 李 娟， 郭小娟

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院1血液內(nèi)科，2外科實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510080)

多發(fā)性骨髓瘤目前尚未有治愈的方法，靶向藥 物治療是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)方向［1］。越來(lái)越多的證據(jù)證實(shí)其血管生成增加并在發(fā)病機(jī)制中起重要作用［2］。沙利度胺、雷利度胺等血管抑制藥物在多發(fā)性骨髓瘤臨床治療中的成功應(yīng)用啟發(fā)了血管抑制藥物作用于血液病腫瘤的新道路。重組人血管內(nèi)皮抑素(recombined human endostatin)是一種新型有效的血管抑制劑，具體作用機(jī)制尚未明朗，國(guó)外大部分研究認(rèn)為其僅作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［3-4］、抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移［5］等抵抗新生血管生成，而對(duì)多種腫瘤細(xì)胞無(wú)明顯促凋亡作用［4-5］。但亦有研究報(bào)道其可下調(diào)腫瘤細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)［6］。恩度(Endostar)作為唯一上市的重組人血管內(nèi)皮抑素，目前已成功應(yīng)用于初治或復(fù)治的Ⅲ～Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌患者的臨床治療，而在多發(fā)性骨髓瘤方面的研究較少，僅有個(gè)別報(bào)道其可在體外直接促進(jìn)人骨髓瘤細(xì)胞CZ-1 凋亡［7］。本實(shí)驗(yàn)用恩度在體外直接作用于人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞RPMI 8226，觀察細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期及血管細(xì)胞黏附因子1(vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1)、白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL-6)和VEGF 表達(dá)的改變，以進(jìn)一步研究重組人血管內(nèi)皮抑素抗多發(fā)性骨髓瘤的作用。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞與試劑

人RPMI 8226 細(xì)胞株為中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科傳代培養(yǎng)，RPMI-1640 空白培養(yǎng)基凱基和胎牛血清(Gibco);CCK8 試劑盒(日本同仁);總RNA 提取試劑RNAiso(TaKaRa);PCR 引物由速聚生物公司合成;SYBR Green qPCR SuperMix 購(gòu)自Invitrogen;CST 蛋白電泳分子量標(biāo)記(15 ～130 kD);兔抗人VCAM-1、IL-6 和VEGF 單克隆抗體購(gòu)自Epitomics;兔抗人GAPDH、Bcl-2 單克隆抗體、兔抗人caspase-3多克隆抗體和山羊抗兔IgG 購(gòu)自Santa Curz;IL-6 和VEGF 細(xì)胞因子ELISA 試劑盒購(gòu)自凱基公司。恩度購(gòu)自山東先聲麥得津生物制藥有限公司。

2 人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞RPMI 8226 培養(yǎng)

以含10%胎牛血清、8 ×104U/L 青霉素和0.08 g/L 鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)人RPMI 8226細(xì)胞于25 cm2懸浮細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 ～3 d 待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期傳代1 次。

3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，每孔2 ×104個(gè)細(xì)胞接種于96 孔板，以倍比稀釋法加入0 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、250 mg/L 和500 mg/L 恩度，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 及72 h，每孔加入10 μL CCK8 試劑，37 ℃孵育4 h 后，用酶標(biāo)儀于450 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度，每個(gè)濃度設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。

4 細(xì)胞凋亡及周期實(shí)驗(yàn)

4.1 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 取對(duì)數(shù)期細(xì)胞以每孔5 ×105個(gè)細(xì)胞接種于6 孔板，加入0 mg/L、100 mg/L 和250 mg/L 恩度原液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)72 h，收集細(xì)胞并以PBS 洗滌2 次，以Annexin V/PI 雙染法染色并立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

4.2 細(xì)胞周期檢測(cè) 每孔2 ×105個(gè)對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種于6 孔板，加入0 mg/L、100 mg/L 和250 mg/L 恩度原液，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，收集細(xì)胞并以70% 乙醇固定過夜，800 r/min 離心3 min并以預(yù)冷PBS 洗滌3 次，以PI 染色法染色，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期變化。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

5 實(shí)時(shí)定量PCR 實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，每孔1 ×106接種于6 孔板，加入0 mg/L 和100 mg/L 恩度原液，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱共同培養(yǎng)72 h，用以測(cè)定VCAM-1 mRNA 表達(dá);同樣條件細(xì)胞接種于6 孔板，每孔加入100 mg/L 恩度，分別于0、12、24、48 和72 h 收集細(xì)胞用以測(cè)定IL-6 和VEGF mRNA 表達(dá);上述收集細(xì)胞以RNAiso提取總RNA，在BioPhotometer Plus 艾本德核酸蛋白測(cè)定儀上測(cè)定RNA 含量，1%瓊脂糖凝膠電泳80V×20 min，凝膠成像系統(tǒng)顯示清晰的5S rRNA，18S rRNA 和28S rRNA 條帶，將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA 并進(jìn)行擴(kuò)增，VCAM-1、IL-6、VEGF 上下游引物見表1。用β-actin 表達(dá)量作為內(nèi)參照，用ABI PRISM? 7500 Sequence Detection System 定量PCR 儀，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以對(duì)照組mRNA 所測(cè)表達(dá)量作為參照值，采用2-ΔΔCt方法精確各目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR 目的片段引物Table 1. Primer sequences for real-time PCR

6 Western blotting 實(shí)驗(yàn)

以凱基全蛋白提取試劑盒說(shuō)明書方法提取細(xì)胞RPMI 8226 細(xì)胞總蛋白，BCA 蛋白定量試劑盒定量后于-20 ℃保存，取含蛋白30 μg 的蛋白提取液上清進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE，8%或12%分離膠)，將分離后的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入抗VCAM-1(1∶1 000)、抗IL-6(1∶800)、抗VEGF(1 ∶800)、抗Bcl-2 (1 ∶500)、抗GAPDH(1∶2 000)單克隆抗體和抗caspase-3(1∶500)多克隆抗體4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜后以Ⅱ抗(1∶1 000 ～2 000)孵育1 h，TBST 洗膜后用ECL 法顯示抗原-抗體復(fù)合物于暗室X 膠片曝光，掃描條帶并用Quantity One 軟件分析條帶積分吸光度值(integrated absorbance，IA)，以靶蛋白IA/GAPDH IA 的比值對(duì)比細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)水平。

7 ELISA 實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)期RPMI 8226 細(xì)胞以1 ×109/L 接種于6孔板，以恩度0 mg/L 和100 mg/L 分別作用于細(xì)胞36、48 和72 h，分別提取上清液以雙抗夾心法檢測(cè)各時(shí)點(diǎn)細(xì)胞上清液中IL-6 及VEGF 的分泌量。每個(gè)樣本設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0 軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ±SD)表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析(Oneway ANOVA)，多組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 恩度抑制RPMI 8226 細(xì)胞增殖並增加G1 期細(xì)胞比例

與空白組比較，50 mg/L、100 mg/L、250 mg/L 和500 mg/L 恩度作用于RPMI 8226 細(xì)胞48 h，增殖抑制率分別為(15.8 ±1.6)%、(16.1 ±3.0)%、(20.4±1.8)%和(18.8 ± 1.1)%(P ＜0.05)。72 h 增殖抑制率分別為(34. 4 ± 8. 4)%、(44. 8 ± 3. 4)%、(59.5 ± 5. 6)% 和(45. 3 ± 4. 7)% (P ＜0. 05)。0 mg/L、100 mg/L 和250 mg/L 恩度作用于RPMI 8226 細(xì)胞72 h 后G1期細(xì)胞比例分別為(59.8 ±0.5)%、(63.5 ±0.2)%和(64.4 ±0.2)%(P ＜0.05)，見圖1。

Figure 1. The effect of 0 mg/L，100 mg/L and 250 mg/L endostar on proportion of G1 phase of RPMI 8226 cells after 72 h.圖1 恩度對(duì)RPMI 8226 細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

2 恩度對(duì)RPMI 8226 細(xì)胞凋亡無(wú)明顯影響

如圖2 所示，0 mg/L、100 mg/L 和250 mg/L 恩度作用于RPMI 8226 細(xì)胞72 h，各組細(xì)胞凋亡率分別為(6. 5 ± 1. 2)%、(5. 9 ± 0. 4)% 和(6. 3 ±0.4)%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。

用100 mg/L 恩度作用RPMI 8226 細(xì)胞6、12、24、48 和72 h，Bcl-2 及caspase-3 蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P ＞0.05)，見圖3。

3 恩度抑制RPMI 8226 細(xì)胞表達(dá)VCAM-1

3.1 VCAM-1 mRNA 表達(dá)變化 如圖4 所示，100 mg/L 恩度作用于RPMI 8226 細(xì)胞72 h 后，VCAM-1 mRNA 較未加藥組下降55%(P ＜0.05)。

3.2 VCAM-1 蛋白表達(dá)變化 100 mg/L 恩度作用于RPMI 8226 細(xì)胞后0、6、12、24、48 和72 h，VCAM-1 蛋白表達(dá)結(jié)果見圖5，72 h 較0 h 蛋白表達(dá)下降50.12%(P ＜0.05)。

Figure 2. The effect of 0 mg/L，100 mg/L and 250 mg/L Endostar on apoptosis of RPMI 8226 cells after 72 h.圖2 恩度對(duì)RPMI 8226 細(xì)胞凋亡率的影響

Figure 3. The effect of 100 mg/L Endostar on the protein expression of Bcl-2 and caspase-3. Mean±SD. n=18.圖3 恩度對(duì)RPMI 8226 細(xì)胞Bcl-2 和caspase-3 表達(dá)的影響

Figure 4. The effect of 100 mg/L Endostar on the mRNA expression of VCAM-1 after 72 h. Mean ±SD. n =6. * P ＜0.05 vs control.圖4 恩度對(duì)RPMI 8226 細(xì)胞VCAM-1 mRNA 表達(dá)的影響

Figure 5. The effect of 100 mg/L Endostar on the protein expression of VCAM-1. Mean±SD. n=18. * P ＜0.05 vs control.圖5 恩度對(duì)RPMI 8226 細(xì)胞VCAM-1 表達(dá)的影響

4 恩度抑制RPMI 8226 細(xì)胞IL-6 及VEGF 表達(dá)

4.1 IL-6 及VEGF mRNA 表達(dá)變化 100 mg/L 恩度作用于RPMI 8226 細(xì)胞后IL-6 和VEGF mRNA 變化結(jié)果見圖6。12、24、48 和72 h IL-6 mRNA 分別下降65%、88%、61%和40%，與對(duì)照組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P ＜0.05)。作用12 和24 h，VEGF mRNA 分別較對(duì)照組下降79%和87%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P ＜0.05);作用48 和72 h，VEGF mRNA較對(duì)照組無(wú)明顯下降(均P ＞0.05)。

Figure 6. The effect of 100 mg/L Endostar on the mRNA expression of IL-6(A)and VEGF(B). Mean ± SD. n =15. * P ＜0.05 vs control.圖6 恩度對(duì)RPMI 8226 細(xì)胞IL-6 和VEGF mRNA 表達(dá)的影響

4.2 IL-6 和VEGF 胞內(nèi)蛋白表達(dá)變化 結(jié)果如圖7所示，100 mg/L 恩度作用于RPMI 8226 細(xì)胞18 h，較未加藥組IL-6 蛋白表達(dá)顯著降低31.90% (P ＜0.05)，100 mg/L 恩度作用于RPMI 8226 細(xì)胞48 h，較未加藥組VEGF 蛋白表達(dá)顯著下降31.50%(P ＜0.05)。

Figure 7. The effect of 100mg/L Endostar on protein expression of IL-6(A)after 18 h and of VEGF(B)after 48 h.Mean±SD. n=6. * P ＜0.05 vs control.圖7 恩度對(duì)RPMI 8226 細(xì)胞IL-6 和VEGF 蛋白表達(dá)的影響

4.3 細(xì)胞上清中IL-6 和VEGF 分泌量的變化 如圖8 所示，100 mg/L 恩度作用于RPMI 8226 細(xì)胞36、48 和72 h，較未加藥組IL-6 分泌量分別下降34.42%、43.65%和10.63%(均P ＜0.05)，36 和48 h VEGF 分泌量分別下降18.71%和23.22%(均P ＜0.05)，72 h VEGF 分泌量較對(duì)照組無(wú)明顯差異(P ＞0.05)。

討 論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，恩度在體外對(duì)人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞RPMI 8226 的增殖有直接抑制作用，250 mg/L以內(nèi)增殖抑制率呈時(shí)間依賴性和濃度依賴性，250 mg/L恩度作用于RPMI 8226 72 h 達(dá)最高抑制率(59.5 ±5.6)%(P ＜0.05)，提示其在體外有抗多發(fā)性骨髓瘤增殖的作用，直接作用于腫瘤細(xì)胞為其作用機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)以0 mg/L、100 mg/L 和250 mg/L 恩度刺激RPMI 8226 細(xì)胞72 h，凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western blotting 驗(yàn)證100 mg/L 恩度作用于RPMI 8226 細(xì)胞6、12、24、48 和72 h 后，凋亡抑制蛋白Bcl-2 和促凋亡蛋白caspase-3 在各時(shí)點(diǎn)表達(dá)無(wú)明顯改變，即本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)及蛋白水平均未檢測(cè)到凋亡相關(guān)變化，提示恩度對(duì)RPMI8226細(xì)胞凋亡無(wú)明顯影響。國(guó)內(nèi)有文獻(xiàn)報(bào)道恩度可以促使骨髓瘤細(xì)胞株CZ-1 凋亡［7］，CZ-1 是2002 年由國(guó)內(nèi)學(xué)者建立的分泌單克隆λ 輕鏈的人骨髓瘤細(xì)胞株，RPMI 8226 細(xì)胞于1966 年由Matswoka 建立，2 株骨髓瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性、免疫表型不盡相同［8］，可能導(dǎo)致了它們對(duì)同一種藥物的促凋亡作用產(chǎn)生不同的敏感性。實(shí)驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn)恩度有阻滯細(xì)胞于G1期的趨勢(shì)，0 mg/L、100 mg/L、250 mg/L 恩度作用細(xì)胞72 h，檢測(cè)G1期比例分別為(59.8 ±0.5)%、(63.5±0.2)%和(64.4 ±0.2)%(P ＜0.05)，因觀察到的阻滯作用較小，推論其抑制RPMI 8226 細(xì)胞增殖可能與改變細(xì)胞周期、阻滯細(xì)胞于G1期相關(guān)，但阻滯作用有限。

Figure 8. The effect of 100 mg/L Endostar on the secretion of IL-6(A)and VEGF(B). Mean±SD. n=18. * P ＜0.05 vs control.圖8 恩度對(duì)RPMI 8226 細(xì)胞IL-6 和VEGF 分泌的影響

IL-6 也被稱為B 細(xì)胞分化因子或漿細(xì)胞瘤生長(zhǎng)因子，其可刺激活化B 細(xì)胞向漿細(xì)胞的分化及免疫球蛋白的分泌［9］，又能促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞增殖［10］，被認(rèn)為在骨髓瘤發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用。VEGF 與IL-6 在多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病機(jī)制中相輔相成，IL-6 可刺激漿細(xì)胞分泌VEGF［13］，而VEGF 一方面促進(jìn)骨髓微環(huán)境血管生成［11］，另一方面又直接促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞增殖和遷移［12］?，F(xiàn)已證實(shí)IL-6 和VEGF 不僅可以由骨髓基質(zhì)細(xì)胞旁分泌產(chǎn)生而作用于骨髓瘤細(xì)胞，亦可由骨髓瘤細(xì)胞自分泌產(chǎn)生，自分泌細(xì)胞因子為多發(fā)性骨髓瘤疾病發(fā)生機(jī)制的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，其可誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞相互刺激進(jìn)一步導(dǎo)致腫瘤相關(guān)細(xì)胞因子的循環(huán)分泌［13］。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)RPMI 8226 細(xì)胞可以分泌IL-6 及VEGF。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，恩度可以抑制RPMI 8226 細(xì)胞分泌IL-6 及VEGF，100 mg/L 恩度作用于RPMI 8226 細(xì)胞24 h 后，IL-6 和VEGF mRNA 水平下降均達(dá)到最大值，分別為88%和87%(均P ＜0.05)。以未加藥組培養(yǎng)相同時(shí)間做對(duì)照，從作用18 h 開始可以觀察到細(xì)胞內(nèi)IL-6 蛋白表達(dá)較對(duì)照組減低，達(dá)31.90%(P ＜0.05)，48 h 后觀察到VEGF 蛋白表達(dá)較未加藥組減低31.50%(P ＜0.05)。2 種細(xì)胞因子均在36 h后較未加藥組減低(P ＜0.05)。其中恩度對(duì)VEGF mRNA 水平抑制作用時(shí)間短暫，24 h 后表達(dá)水平迅速回升，而胞內(nèi)蛋白表達(dá)及細(xì)胞外分泌在48 h 時(shí)仍觀察到表達(dá)抑制現(xiàn)象，但抑制作用較弱，考慮一方面VEGF 蛋白水平表達(dá)可能較mRNA 水平延遲，另一方面mRNA 表達(dá)迅速回升可能是限制恩度作用于細(xì)胞蛋白水平的原因。

VCAM-1 在多發(fā)性骨髓瘤患者血清中表達(dá)升高［14］，是骨髓微環(huán)境中起重要作用的黏附分子，多項(xiàng)研究證實(shí)其可促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞的緊密結(jié)合［15-17］，并進(jìn)一步刺激骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌IL-6［16-17］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)恩度亦能在mRNA 及蛋白水平下調(diào)RPMI 8226 細(xì)胞VCAM-1 的表達(dá)，100 mg/L 恩度作用于細(xì)胞72 h VCAM-1 mRNA 較對(duì)照組下降55%(P ＜0.05)，72 h 胞內(nèi)蛋白表達(dá)量較0h 下降50.12%(P ＜0.05)。提示抑制細(xì)胞黏附因子表達(dá)亦為恩度直接作用于多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞產(chǎn)生抗骨髓瘤作用機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)之一。

上述結(jié)果表明恩度在體外可直接作用于人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞RPMI 8226，對(duì)其產(chǎn)生增殖抑制、周期改變和下調(diào)VCAM-1 及IL-6、VEGF 表達(dá)的作用，由此推斷其可影響多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞相互作用，具有抗多發(fā)性骨髓瘤的潛力。恩度作為以針對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞作用為主的血管生成抑制劑，其抗多發(fā)性骨髓瘤作用尚需在骨髓微環(huán)境及與骨髓瘤細(xì)胞的相互作用中得到進(jìn)一步闡述。恩度對(duì)多發(fā)性骨髓瘤骨髓微環(huán)境的作用尚缺乏相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，其潛在抗多發(fā)性骨髓瘤作用及其機(jī)制有待于深入研究。

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