強(qiáng)精膠囊對(duì)精索靜脈曲張大鼠附睪顯微結(jié)構(gòu)的影響

尹 靜，王 超，張蜀武，曲曉偉

精索靜脈曲張(varicocele,VC)是引起男性不育常見的原因之一，成年男性中有2%～22%的人有此疾患。在精液常規(guī)檢查異常的病人中, 患病率可高達(dá)25%～40%[1]。手術(shù)是治療VC的常用方法之一，但很多學(xué)者對(duì)手術(shù)在改善精液質(zhì)量和增強(qiáng)生育能力方面的作用提出了質(zhì)疑[2]。我們通過觀察強(qiáng)精膠囊對(duì)VC大鼠附睪形態(tài)結(jié)構(gòu)以及精子質(zhì)量的影響，探討該復(fù)方中藥對(duì)附睪顯微結(jié)構(gòu)可能的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 青春期雄性SD 大鼠100 只，2 月齡，體質(zhì)量（200±20）g，常規(guī)飼養(yǎng)（成都中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供）。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物自由攝食飲水，室溫控制在20～25℃，相對(duì)濕度40%～60%。

1.2 主要設(shè)備 北京偉力彩色精子質(zhì)量檢測系統(tǒng)、MA110 電子天平、德國萊卡石蠟切片機(jī)、奧林巴斯顯微鏡BX41 型、MIAS-2000 型圖形圖象分析系統(tǒng)等。

1.3 動(dòng)物模型制備 大鼠馴化飼養(yǎng)1 周，觀察無異常后造模。隨機(jī)抽取10只為假手術(shù)組，其余90只以縮窄左腎靜脈建立大鼠VC模型。模型建立參照文獻(xiàn)方法[3]，用5%水合氯醛(6 mL/kg)腹腔注射麻醉，將大鼠仰臥固定于夾板。常規(guī)消毒，腹部正中切口，暴露出左腎、左腎上腺靜脈、下腔靜脈、左腎靜脈及左精索靜脈入左腎靜脈處，分離左腎靜脈。在左腎上腺靜脈和精索靜脈內(nèi)側(cè)、下腔靜脈外側(cè)的左腎靜脈下分離出一通道，在通道內(nèi)穿出一根3/0 絲線。置一根直徑約為0.55 mm 的金屬桿，與左腎靜脈一起結(jié)扎，抽出金屬桿，使左腎靜脈復(fù)通，造成左腎靜脈的部分狹窄，使左腎靜脈直徑縮小約一半。假手術(shù)組大鼠顯露左腎靜脈過程相同，但不結(jié)扎。

1.4 動(dòng)物模型分組 于造模后4 周麻醉大鼠，剖腹觀察。用帶測微器的目鏡測量精索靜脈直徑，觀察其曲張程度。假手術(shù)組大鼠左側(cè)精索靜脈未見擴(kuò)張，模型大鼠則明顯擴(kuò)張，直徑約是假手術(shù)組3 倍，呈膨脹彎曲狀，且兩個(gè)腎臟大小無明顯差別。共計(jì)72 只模型大鼠達(dá)到此效果。另18 只大鼠由于麻醉過量、手術(shù)失敗、術(shù)后感染死亡等因素退出實(shí)驗(yàn)。將成功模型大鼠（n=72）隨機(jī)分為模型組、強(qiáng)精膠囊高中低劑量組、五子衍宗膠囊組、少腹逐瘀膠囊組，每組12只。

1.5 藥物制備 強(qiáng)精膠囊方由仙靈脾、仙茅、菟絲子、枸杞子、熟地、當(dāng)歸、川芎、紅花、丹參、雞血藤、生黃芪、川牛膝組成（四川省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房提供）。按照人與大鼠體表面積比換算等效劑量，高、中、低劑量組大鼠給藥劑量為2.16 g/kg、1.08 g/kg、0.54 g/kg，分別相當(dāng)于成人日用量的20、10、5倍。使用前用生理鹽水分別配制成0.216 g/mL、0.108 g/mL、0.054 g/mL。五子衍宗膠囊（河北紫薇山制藥有限責(zé)任公司）組給藥劑量為1.30 g/kg，相當(dāng)于成人日用量的20 倍，用前用生理鹽水配制成0.130 g/mL 的混懸液。少腹逐瘀膠囊（東阿澳東藥業(yè)有限公司）組給藥劑量為1.46 g/kg，相當(dāng)于成人日用量的20 倍，用前用生理鹽水配制成0.146 g/mL的混懸液。

1.6 藥物用法 各組大鼠灌胃均1次/d，連續(xù)給藥4周。假手術(shù)組與模型組給予生理鹽水10 mL/kg；強(qiáng)精膠囊高、中、低劑量組、五子衍宗膠囊組、少腹逐瘀膠囊組分別給予上述混懸液10 mL/kg。

1.7 精液標(biāo)本制備與檢測 于末次給藥后24 h，稱大鼠體質(zhì)量，斷頸處死，無菌條件下摘下左側(cè)附睪組織，用眼科剪在附睪尾部剪一個(gè)小口，收集精液。用偉力彩色精子質(zhì)量檢測系統(tǒng)檢查精液常規(guī)。

1.8 附睪光鏡標(biāo)本制備與檢測 稱重后，迅速置于10%中性福爾馬林液中,固定48 h，逐級(jí)酒精脫水,二甲苯透明、石蠟包埋, 常規(guī)切片5 μm，60 ℃烤箱烤8 h，玻片用APES 處理。光學(xué)顯微鏡觀察并攝像圖像保存。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，各組間比較采用單因素方差分析，其中方差齊者用LSD法，方差不齊者用Dunnett T3 法檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 造模后各組大鼠出現(xiàn)不同程度的攝食減少，精神萎靡，毛發(fā)枯黃，缺乏光澤，逐漸出現(xiàn)惡寒倦臥，反應(yīng)遲鈍，少動(dòng)，體毛干枯脫落，消瘦等癥狀，在灌胃藥物1 周后逐漸開始改善。治療過程中模型組大鼠死亡3只，強(qiáng)精膠囊低、中劑量組各1只，高劑量組2只，五子衍宗膠囊組1只，少腹逐瘀膠囊組2只，共10只。死亡原因?yàn)樾g(shù)后感染、灌胃操作不當(dāng)及大鼠相互斗咬等。

2.2 附睪精子活力與密度 模型組大鼠附睪精子活力與密度低下；強(qiáng)精膠囊高劑量組、中劑量組以及五子衍宗膠囊組精子活力與密度較模型組明顯增高(P ＜0.01)；強(qiáng)精膠囊高劑量組精子活力與密度較中、低劑量組、五子衍宗膠囊組、少腹逐瘀膠囊組明顯增高(P ＜0.01)；強(qiáng)精膠囊中劑量組、五子衍宗膠囊組精子活力與密度較低劑量組、少腹逐瘀膠囊組明顯增高(P ＜0.01)，但強(qiáng)精膠囊中劑量組與五子衍宗膠囊組相比差別不明顯(P ＞0.05)；強(qiáng)精膠囊低劑量組精子活力與密度與少腹逐瘀膠囊組相比差別不明顯(P＞0.05)。見表1。

表1 各組大鼠精子活力、密度的比較（x±s）

2.3 附睪的形態(tài)結(jié)構(gòu) 光鏡下，假手術(shù)組附睪上皮是由主細(xì)胞、基細(xì)胞、暈細(xì)胞和亮細(xì)胞等構(gòu)成的假復(fù)層柱狀上皮，附睪管各段所含的各種細(xì)胞比例各不相同，具有細(xì)胞分布的區(qū)域性特征，但均以主細(xì)胞數(shù)量最多（圖1-a）。附睪管腔面可見刷狀緣（圖1-b），管腔內(nèi)含大量正常精子，附睪間質(zhì)內(nèi)可見正常纖維、成纖維細(xì)胞、小血管等。

模型組表現(xiàn)為間質(zhì)水腫，小血管淤血擴(kuò)張（圖2-a）；大量淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤；間質(zhì)中出現(xiàn)精子肉芽腫（圖2-b），其中心是大量溢出的精子，周圍出現(xiàn)大量圓形和上皮樣的精子吞噬細(xì)胞。附睪管萎縮，上皮退化變性，細(xì)胞排列紊亂，甚至出現(xiàn)空泡化變性（圖2-c），上皮內(nèi)暈細(xì)胞和亮細(xì)胞數(shù)量明顯增加。管腔內(nèi)出現(xiàn)大量未成熟生精細(xì)胞、精子殘余體、巨噬細(xì)胞、畸形精子等（圖2-d）。

強(qiáng)精膠囊高劑量組附睪上皮以主細(xì)胞為主（圖3-a），細(xì)胞排列較為整齊，有少量淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤（圖3-b），附睪間質(zhì)水腫不明顯，可見正常纖維、成纖維細(xì)胞，附睪管腔面可見刷狀緣（圖3-c），管腔內(nèi)含大量正常精子和少量精子殘余體、畸形精子。

強(qiáng)精膠囊中劑量組附睪上皮仍以主細(xì)胞為主（圖4-a），但上皮內(nèi)暈細(xì)胞和亮細(xì)胞數(shù)量增加，細(xì)胞排列不太整齊，可見上皮退化變性，有淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤、積聚（圖4-b），附睪間質(zhì)可見輕度水腫和小血管擴(kuò)張（圖4-c），管腔內(nèi)可見正常精子、未成熟生精細(xì)胞、精子殘余體、畸形精子（圖4-d）。五子衍宗膠囊組除附睪間質(zhì)水腫和小血管擴(kuò)張較明顯外，其余改變與強(qiáng)精膠囊中劑量組相似（圖5-a）。

強(qiáng)精膠囊低劑量組大鼠附睪的主要病理表現(xiàn)在模型組的基礎(chǔ)上有輕微改善，但不明顯（圖6）。少腹逐瘀膠囊組與強(qiáng)精膠囊低劑量組相似（圖7）。

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，精索靜脈曲張性不育多屬“筋瘤”、“筋疝”、“無子”等范疇，其病因病機(jī)復(fù)雜，概括起來不外乎本虛標(biāo)實(shí)，以腎虛為本，血瘀為標(biāo)，腎虛導(dǎo)致血瘀，血瘀加重腎虛，互為因果，相互影響，造成生殖之精化生障礙，從而導(dǎo)致不育[4]。強(qiáng)精膠囊是我們根據(jù)古今醫(yī)家對(duì)VC性不育腎虛血瘀基本病機(jī)的認(rèn)識(shí)，結(jié)合多年臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)而創(chuàng)立的補(bǔ)腎活血方。本方可補(bǔ)腎以生精，活血以化淤，標(biāo)本兼顧，使腎氣得以充，瘀血得以去，外腎的生精功能得以恢復(fù)，生殖之精不斷產(chǎn)生。經(jīng)多年臨床應(yīng)用及臨床觀察，取得了較好療效。本研究中對(duì)照組采用具有補(bǔ)腎作用的五子衍宗膠囊和具有活血作用的少腹逐瘀膠囊治療，分別對(duì)精索靜脈曲張腎虛病機(jī)和血瘀病機(jī)進(jìn)行探討。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)關(guān)于精索靜脈曲張性不育發(fā)生機(jī)制的研究尚未完全明確。VC 時(shí)，附睪靜脈血液淤積，造成回流障礙，動(dòng)脈灌注阻力增加使動(dòng)靜脈灌注失衡，造成局部缺血、代謝產(chǎn)物堆積，甚至引起血管內(nèi)皮受損，血管活性物質(zhì)異常釋放，白細(xì)胞聚集或血小板黏附，血液循環(huán)功能持續(xù)性障礙，最終引起附睪管上皮細(xì)胞代謝紊亂，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。附睪上皮結(jié)構(gòu)改變必然導(dǎo)致其分泌功能異常，從而改變管腔內(nèi)液體的成分而使微環(huán)境發(fā)生改變，使精子在附睪內(nèi)的成熟過程受到影響。其原因可能與精索靜脈曲張改變了附睪的血流動(dòng)力學(xué)，影響了附睪組織的正常代謝有關(guān)。因此，VC 引起附睪結(jié)構(gòu)改變、細(xì)胞凋亡及其微環(huán)境發(fā)生改變可能是引起不育的原因之一。

圖1 假手術(shù)組HE（×400）

圖2 模型組HE（×400）

圖3 強(qiáng)精膠囊高劑量組HE（×400）

圖4 強(qiáng)精膠囊中劑量組HE（×400）

圖5 五子衍宗膠囊組HE（×400）

圖6 強(qiáng)精膠囊低劑量組HE（×400）

圖7 少腹逐淤膠囊組HE（×400）

本實(shí)驗(yàn)以附睪結(jié)構(gòu)與精子成熟的相關(guān)性為切入點(diǎn)，觀察強(qiáng)精膠囊對(duì)模型大鼠附睪精子活力、密度及附睪形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果顯示，強(qiáng)精膠囊可提高精子密度、活力，改善VC 對(duì)附睪形態(tài)結(jié)構(gòu)的損傷；僅有補(bǔ)腎作用的五子衍宗膠囊和僅有活血作用的少腹逐瘀膠囊對(duì)VC造成附睪形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷改善不明顯。因此，推測強(qiáng)精膠囊提高生育力的可能作用機(jī)制為：強(qiáng)精膠囊可以改善睪丸、附睪與精索內(nèi)局部微循環(huán)，促進(jìn)局部血液的流動(dòng)，抑制血管活性物質(zhì)異常釋放，抑制間質(zhì)水腫、上皮細(xì)胞變性，抑制細(xì)胞過度凋亡，從而改善其合成、分泌以及轉(zhuǎn)運(yùn)功能，改善附睪腔液微環(huán)境，進(jìn)而促進(jìn)附睪精子成熟。本實(shí)驗(yàn)為強(qiáng)精膠囊的臨床運(yùn)用提供了理論依據(jù)，并有望為精索靜脈曲張性不育的臨床治療開拓新的途徑。

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