中藥調(diào)節(jié)Th1/Th2免疫平衡在下肢深靜脈血栓形成治療中的作用

王 彬，劉 明，郝清智，宋福晨，李 霞

深靜脈血栓形成（deep vein thrombosis，DVT）年發(fā)病率約1.0‰[1]，急性期容易出現(xiàn)肺栓塞而危及生命，慢性期因靜脈瓣膜破壞導致患肢腫脹、淤積性皮炎、頑固性小腿潰瘍等后遺癥。研究證實，DVT 模型大鼠存在細胞因子網(wǎng)絡失衡的現(xiàn)象[2]，但導致這一現(xiàn)象的免疫學根源尚未明確。血管內(nèi)皮是循環(huán)T細胞最早接觸的場所，受T 細胞亞群及其產(chǎn)生細胞因子的直接作用，T 細胞亞群分化失衡可直接損傷血管內(nèi)皮細胞（vascular endothelial cells，VEC），損傷的VEC 又可招募并激活更多T 細胞，從而放大炎癥損傷。我們于2011 年1 月—2012 年6 月，通過觀察DVT 患者外周血Th1、Th2 細胞比例變化及血漿中Th1、Th2細胞特征因子腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、干擾素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）、白介素-4（Interleukin-4，IL-4）和白介素-10（Interleukin-10，IL-10）水平，探討Th1、Th2 亞群在DVT 發(fā)病中的作用及消栓通脈顆粒治療本病的靶點與機制。

1 資料與方法

1.1 研究對象 納入病例標準為急性期混合型單純下肢深靜脈血栓形成[3]，單側肢體發(fā)病，病程在15 d以內(nèi)。排除不符合上述標準及有出血性疾病或出血傾向者。本組共60例，隨機數(shù)字表法分為中西醫(yī)結合組（結合組）和西藥組。結合組30 例，男14例，女16 例；年齡（52±11）歲。西藥組30 例，男19例，女11 例；年齡（50±13）歲。2 組發(fā)病部位、發(fā)病時間比較無顯著差異（P ＞0.05）。選取同期健康查體者30 例，納入正常組，男16 例，女14 例；年齡（44±12）歲。3 組間年齡、性別比較無顯著差異（P＞0.05）。

1.2 藥物及試劑 消栓通脈顆粒由茵陳、金銀花、赤小豆、桃仁、黃柏等藥物組成，具有清熱利濕、祛瘀通絡功效，由山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥學部生產(chǎn)（魯藥制字Z0120030051），每包10 g。尿激酶麗珠制藥廠生產(chǎn)，國藥準字H44020645，每支10萬U。低分子肝素鈣注射液葛蘭素史克公司生產(chǎn)，進口藥品注冊證號H20080480，每支0.4 mL：4100AxaIU。RPMI1640 (Gibco 公司)，離子霉素和莫能霉素均購自Sigma公司。TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10抗體均購自美國BD公司。

1.3 主要儀器 高速低溫離心機(SORVALL SUPER T21，USA)，流式細胞儀(BECKMAN，USA)。

2 方法

2.1 用藥方法 西藥組給予尿激酶20 萬U 靜滴，1次/d，連續(xù)用藥14 d；低分子肝素鈣4100 U 皮下注射，1 次/d，連續(xù)用藥14 d。結合組在西藥組用藥的基礎上口服消栓通脈顆粒，每次10 g，2次/d，連續(xù)用藥14 d。

2.2 標本采集 空腹狀態(tài)經(jīng)肘靜脈抽血4 mL，裝入抗凝管中，分離血漿分裝至EP 管，保存于-80 ℃冰箱，分離外周血單個核細胞用于流式細胞術檢測。

2.3 Th1、Th2細胞比例的測定 標本以等體積PBS稀釋，采用人淋巴細胞分離液獲取外周血單個核細胞，RPMI1640 調(diào)整細胞濃度至2×106/mL，接種至24孔板，加入佛波酯(50 μg/L)、離子霉素(1 μM)和莫能霉素(500 μg/L)，37 ℃5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h。收集細胞根據(jù)計數(shù)等分為測定管和同型對照管，加入20 μL PE標記的鼠抗人CD4單抗，4 ℃避光孵育30 min。PBS洗滌2次，固定液室溫避光固定反應20 min，離心棄去上清，PBS 洗滌2 次。加入破膜劑進行細胞打孔利于細胞因子染色，離心棄去上清后予細胞因子染色。測定管分別加入FITC 標記的鼠抗人TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10，對照管加入同型對照，4 ℃避光孵育30 min，1×穿膜緩沖液洗2次，1×PBS 重懸細胞，轉管，上機檢測。Winmidi 2.9 分析Th1(CD3+CD4+IFNγ+)、Th2(CD3+CD4+IL-4+)亞群占CD4+細胞百分比。

2.4 Th1、Th2 細胞特征細胞因子的檢測 采用ELISA法，所有步驟均按照說明書進行，通過標準曲線求得血樣中TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10濃度。2.5 觀察指標 ⑴各組Th1、Th2 細胞比例及TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10濃度。⑵肢圍測定：混合型DVT患者大腿中段及小腿中段肢圍變化明顯，在治療前及末次用藥后測量患者髕骨上緣上15 cm大腿中段、髕骨下緣下15 cm處小腿中段肢圍。

2.6 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 11.5 軟件，計量資料以均值±標準差(x±s)表示。采用One Way-ANOVA 方差分析，2 組間比較采用Turkey 法檢驗，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 Th1、Th2細胞特征因子占CD4+細胞百分比及藥物對其影響 治療前結合組、西藥組TNF-α、IFN-γ均高于正常組，IL-4、IL-10 均低于正常組（P ＜0.05）。治療后西藥組、結合組，TNF-α、IFN-γ低于治療前（P ＜0.05）；IL-4、IL-10 高于治療前（P ＜0.05）。治療后結合組TNF-α、IFN-γ均低于西藥組（P <0.05）；結合組IL-4、IL-10高于西藥組（P＜0.05）。見表1。

3.2 中藥復方對Th1/Th2 亞群比例的影響 治療前，結合組、西藥組Th1/Th2比值均高于正常組（P ＜0.05）。治療后，西藥組、結合組TNF-α/ IL-4、IFN-γ/IL-10 比值低于治療前（P ＜0.05）。治療后結合組TNF-α/ IL-4、IFN-γ/IL-10 比值低于西藥組（P＜0.05）。見表2。

2.3 肢圍比較 兩組患者治療后肢圍均低于治療前（P ＜0.05）；消栓通脈組肢圍改善優(yōu)于西藥組 （P＜0.05）。見表3。

表1 3組外周血TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10占CD4+細胞百分比及藥物對其影響（%，x±s）

表2 藥物對3組外周血Th1/Th2比例的影響（x±s）

表3 兩組患者治療前后肢圍比較（cm，x±s）

4 討論

根據(jù)細胞分化和功能特征不同，CD4+T 細胞最初被分為兩個功能亞群：輔助性T細胞1(Thl)和輔助性T細胞2(Th2)，分別執(zhí)行不同的生物學功能。Th1細胞主要分泌TNF-α、IFN-γ和白介素-2（interleukin-2，IL-2），作為致炎性介質(zhì)，可以增強細胞毒性T 細胞和NK 細胞的活性，從而促進細胞免疫應答。Th2 細胞主要分泌IL-4 和IL-10，作為抗炎介質(zhì)，通過使B 淋巴細胞產(chǎn)生抗體發(fā)揮體液免疫作用?，F(xiàn)代免疫學研究認識到T細胞是產(chǎn)生細胞因子的關鍵細胞群，其不同亞群產(chǎn)生不同細胞因子形成復雜的細胞因子網(wǎng)絡，發(fā)揮核心免疫調(diào)節(jié)作用。T細胞表達種類繁多的受體，能敏感地對體內(nèi)外刺激作出應答反應。T細胞亞群之間具有重要的相互調(diào)節(jié)的作用，同時它們又相互抑制，如IFN-γ可以抑制2型輔助性T淋巴細胞的分化，而Th2細胞分泌的IL-4 又能夠抑制Th 細胞向Thl 細胞分化，進而避免了Th1 細胞的過度激活。正常的情況下，機體內(nèi)的Th1/Th2亞群細胞的功能處于動態(tài)平衡之中[4-5]。

IFN-γ可以通過促進脂質(zhì)沉積和誘導巨噬細胞聚集，誘導巨噬細胞凋亡，產(chǎn)生過量的單核細胞趨化因子-1（macophage/monocyte chemotactic protein1，MCP-1），導致內(nèi)皮損傷而促進血管炎癥反應。IL-4可以抑制IFN-γ的產(chǎn)生，同時抑制IFN-γ對巨噬細胞的活化作用，減輕炎癥反應，增進Th0 細胞向Th2的分化[6-7]。IL-10可以抑制促炎細胞因子，下調(diào)單核細胞、巨噬細胞和平滑肌細胞等靶細胞的炎性激活，從而抑制單核/巨噬細胞及平滑肌細胞表達TNF-α、IL-1、IFN-γ、MCP-1等促炎細胞因子，調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，抑制炎癥反應，從而保護靜脈內(nèi)皮細胞[8]。

在DVT初期，我們可以觀察到，Th1亞群比例明顯高于正常組，Th2 亞群比例明顯低于正常組，Th1亞群占主導地位。此時T細胞在MCP-1的作用下，與血管內(nèi)皮細胞結合，以滲出的方式透過內(nèi)皮細胞層進入內(nèi)皮下，參與炎癥反應，加重內(nèi)皮損傷，促進了血栓形成[9-10]。經(jīng)過治療后，結合組及西藥組Th1亞群比例降低，Th2亞群比例升高，肢圍較治療前改善明顯，兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。

消栓通脈顆粒是著名周圍血管病專家侯玉芬教授在臨床上常用的有效中藥制劑，具有清熱利濕、祛瘀通絡的功效。消栓通脈顆粒中茵陳、赤小豆清熱利濕，行血消腫共為君藥。赤芍藥清熱涼血，活血化瘀，水蛭破血逐瘀，通經(jīng)消癥，黃柏清熱燥濕，瀉火解毒，三藥相須配伍合而為臣藥，既助君祛濕、清熱、活血，又能涼血活血、破血祛瘀、軟堅散結，使血脈通暢，水腫自消。山梔清熱，蒼術功擅燥濕健脾，桃仁、紅花活血散瘀。諸藥合用，共奏清熱利濕，祛瘀通絡，消腫止痛之功效，使?jié)窕崆?、瘀祛，脈絡通暢。我們的前期研究證實，DVT急性期炎性細胞因子表達增高，消栓通脈顆?？梢员Ｗo血管內(nèi)皮細胞，降低炎性細胞因子表達[2,11]。本研究中，消栓通脈顆粒可以抑制TNF-α、IFN-γ轉錄，促進IL-4、IL-10表達，升高Th2 亞群比例，優(yōu)勢誘導T 細胞向Th2 亞群偏移，減輕炎癥反應，保護血管內(nèi)皮細胞，促進血栓再通，改善肢體腫脹。但該復方療效物質(zhì)基礎尚不明確，有待于進一步研究。

[1] Kesieme E,Kesieme C,Jebbin N,et al.Deep vein thrombosis:a clin?ical review [J]. J Blood Med,2011,2(2):59-69.

[2] 張玥，劉明，王彬，等.深靜脈血栓形成中促炎癥細胞因子變化的研究[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2007,17（5）：569-571.

[3] 尚德俊，王嘉桔，張柏根.中西醫(yī)結合周圍血管疾病學[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2004：521-522.

[4] Guo M,Mao X,Ji Q,et al.Inhibition of IFN regulatory factor-1 down-regulate Th1cell function in patients with acute coronary syn?drome [J]. J Clin Immunol,2010,30(2):241-252.

[5] Veldhoen M,Hirota K,Christensen J,et al.Natural agonists for aryl hydrocarbon receptor in culture medium are essential for optimal differentiation of Th17 T cells [J]. J Exp Med,2009,206(1):43-49.

[6] Koga M,Kai H,Yasukawa H,et al.Inhibition of progression and stabi?lization of p-laques by postnatal interferon-gamma function block?ing in ApoE-knockout mice [J]. Circ Res,2007,101(4):348-356.

[7] Zhang J,Sun B,Huang Y,et al.IFN-γpromotes THP-1 cell apopto?sis during early infection with Mycobacterium bovis by activating different apoptotic signaling [J]. FEMS Immunol Med Microbiol,2010，60(3):191-198.

[8] Christian A,Gleissner, Arne Zastrow, Rlaud Klingenberg, et al.IL-10inhibits endothelium-dependent T cell costimulation by up-Regulation of ILT3/4 in human Vascular endothelial cells [J].Eur J Immunol,2007,37(1):177-192.

[9] Packard R R,Lichtman A H, Libby P,et al.Innate and adaptive immunity in atherosclerosis [J]. Semin Immunopathol,2009,31(1):5-22.

[10]何少林，李大主，黎明，等.CD4+CD25+調(diào)節(jié)T細胞對內(nèi)皮炎性因子分泌的影響[J]. 中國免疫學雜志，2010,26（12）：1064-1068.

[11]王 彬，李 霞，張 玥，等.炎性細胞水平變化與深靜脈血栓形成中醫(yī)癥候分型關系探討[J]. 山東中醫(yī)藥大學學報，2006，30（2）：131-132.