FISH技術(shù)解析不同氨氮濃度MBR中的微生物群落結(jié)構(gòu)

楊小麗 周 娜 陳 明 張 瑞 宋海亮 傅大放

(1東南大學土木工程學院,南京 210096)

(2東南大學能源與環(huán)境學院,南京 210096)

膜生物反應(yīng)器(membrane bioreactor,MBR)是將生物處理與膜分離技術(shù)有機結(jié)合起來的一種新型污水處理技術(shù)．由于膜組件的高效截留作用,MBR實現(xiàn)了水力停留時間(HRT)和污泥齡(SRT)的完全分離,有利于世代周期較長的硝化細菌的富集增長,使MBR硝化效率增強,但目前對不同硝化強度下MBR中起主要作用的微生物群落結(jié)構(gòu)的變化研究仍較有限[1]．近年來,隨著PCR,SSCP,FISH等現(xiàn)代分子生物技術(shù)的發(fā)展,使得快速準確地鑒定細菌成為可能．在水處理微生物學中,已經(jīng)開始廣泛應(yīng)用現(xiàn)代生物學分子技術(shù)檢測處理體系中微生物群落生態(tài)演替規(guī)律及種群數(shù)量的波動等．其中,FISH是應(yīng)用廣泛、最為有效的技術(shù)之一．

為了探究不同硝化過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的組成變化,本文應(yīng)用FISH技術(shù)對不同氨氮負荷的MBR進行微生物種群檢測．根據(jù)文獻[2-3],本文選擇了污水處理中常見的8種細菌并對其數(shù)量進行檢測分析,分別是:變形菌(α-變形菌(Alphaproteobacteria)、β-變形菌(Betaproteobacteria)、γ-變形菌(Gammaproteobacteria))、放線菌、黃桿菌、綠彎菌、氨氧化細菌、硝化細菌．通過研究,以期真實反映出在不同進水氨氮濃度的MBR中微生物群落結(jié)構(gòu)的組成變化,同時分析其數(shù)量分布及豐度,探索MBR中微生物菌群結(jié)構(gòu)與硝化作用的內(nèi)在關(guān)系,為實際工程進一步提高MBR的處理效果提供理論依據(jù)．

1 實驗方法

1.1 實驗裝置

MBR實驗裝置如圖1所示．

1.2 熒光原位雜交技術(shù)實驗步驟

熒光原位雜交技術(shù)實驗步驟如下：① 進行玻片預(yù)處理、樣品采集與預(yù)處理[4]．② 雜交反應(yīng).在密閉的雜交盒中放入吸水紙,用不含探針的雜交液(SDS 0.1%,Tris-HCl (pH 8.0) 20 mmol/L,甲酰胺濃度見表1)潤濕．用移液槍分別取24 μL雜交液和1 μL探針溶液放入帶有樣品的載玻片上,然后放入雜交盒內(nèi)進行雜交反應(yīng)．總細菌和硝化細菌雜交時間為5 h,其余為2～3 h,雜交溫度均為46 ℃．所有有關(guān)探針的操作應(yīng)避光處理．③ 洗脫反應(yīng).提前將洗脫液(EDTA 56 mmol/L,SDS 0.1%,Tris-HCl (pH 8.0) 20 mmol/L,NaCl濃度根據(jù)雜交液中甲酰胺濃度確定)放入水浴鍋中48 ℃預(yù)熱,然后倒入干燥的雜交盒;將載玻片放入裝有洗脫液的雜交盒中,避光密閉洗脫20 min后除去洗脫液,用ddH2O漂洗2次．④ DAPI染色.取10 μL濃度為1 μg/mL的DAPI加到載玻片樣品上,染色5 min,用甲醇漂洗,加上蓋玻片,用封片劑封片,放在室溫下晾干．

表1 實驗使用的16S和23S rRNA特異寡核苷酸探針序列

待載玻片干燥后,立即使用OLYMPUS-BX41熒光顯微鏡觀察．該熒光顯微鏡配置有3種不同波長的濾光片,分別為:395～415 nm,420～485 nm,460～550 nm．觀測30個視野,用Image-Pro Plus 6.0軟件讀取細菌數(shù)目．對每個樣品進行了3組平行實驗．觀察時每組實驗至少攝取30個視野進行計數(shù)，然后將3組平行樣的計數(shù)結(jié)果進行平均計算[8]．

本實驗所使用的靶向細菌、序列、雜交條件詳見表1．其中探針NIT3用FITC標記,激發(fā)光為亮綠色;其余探針用HEX標記,激發(fā)光為紅色．

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 MBR對污染物的去除效果

表2 MBR對COD和的平均去除效果(n=33)

2.2 MBR微生物群落結(jié)構(gòu)

圖2為3個MBR中細菌的構(gòu)成比較．由圖可看出,3個MBR中,所選細菌涵蓋細菌總量的90%～97%,說明所選細菌具有很好的代表性[12]．在1#MBR中α-變形菌和β-變形菌相對系統(tǒng)中其他細菌來說含量較多,占總細菌的比例分別為18%和21%;其次是氨氧化細菌、硝化細菌、γ-變形菌和綠彎菌,分別占總細菌的15%,13%,12%和10%;放線菌和黃桿菌相對來說含量較低,均不超過6%;另外,3%的細菌未檢測出．Zang等[13]采用FISH方法測試了活性污泥中的優(yōu)勢菌群，得出類似的結(jié)果:α-變形菌和β-變形菌占總細菌的比例均為20%左右；黃桿菌和放線菌相對含量為6%～10%．在2#MBR中優(yōu)勢菌群是β-變形菌,占總細菌數(shù)量的比例為24%;其次是α-變形菌、放線菌、黃桿菌和綠彎菌,占總細菌的比例為15%左右;其余細菌所占比例均不大于5%．在3#MBR中氨氧化細菌為絕對優(yōu)勢菌種,占總細菌的26%;其次是α-變形菌、硝化細菌和β-變形菌,所占比例分別為19%,17%和16%;其他細菌所占比例約為2%～5%．以上結(jié)果表明,不同進水氨氮濃度的MBR經(jīng)過長時間的穩(wěn)定運行后,形成了各自特定的微生物群落結(jié)構(gòu),相同的微生物種群在不同的MBR體系中的優(yōu)勢地位不同．

圖2 3個MBR中細菌的構(gòu)成比較

從圖2中還可看出,變形菌在3個MBR中占總細菌的比例分別是51%,44%,39%,可見變形菌在MBR微生物群落結(jié)構(gòu)中占有明顯優(yōu)勢．張斌等[14]采用PCR-DGGE技術(shù)對處理不同廢水MBR體系中的微生物群落結(jié)構(gòu)比較也發(fā)現(xiàn),變形菌是MBR的主要優(yōu)勢菌落．

圖3是MBR中微生物的熒光顯微圖像．圖3(f)為綠彎菌,在3個MBR中含量均比較少．Bj?rnsson等[10]實驗證明,綠彎菌確實是活性污泥的組成成分之一．在活性污泥系統(tǒng)中綠彎菌是生活在好氧環(huán)境下的,主要以糖類為基質(zhì)[15-16]，因此較低氨氮負荷的MBR更有利于綠彎菌的生存．Kragelund等[16]應(yīng)用MAR-FISH技術(shù)對126座生活污水和工業(yè)廢水處理廠進行的綠彎菌檢測表明,50%的污水廠中檢測到了綠彎菌,其中12%的污水廠中綠彎菌含量比較高,而且是造成污泥膨脹的主要絲狀細菌之一．

圖3(g)、(h)在同一個視野下拍攝的,圖3(g)是2#MBR的熒光顯微圖像,圖3(h)是2#MBR β-變形菌的DAPI圖像,箭頭指向的是該探針檢測到的β-變形菌．由圖可看到,這種細菌在2#MBR中呈絲狀大量分布．此時，2#MBR中放線菌和綠彎菌較其他2個MBR含量增多,與2#MBR呈現(xiàn)污泥膨脹的態(tài)勢相吻合．由此表明,低氨氮負荷的MBR在長期穩(wěn)定運行中更易發(fā)生污泥膨脹,絲狀β-變形菌是引起污泥膨脹的主要絲狀細菌之一．

黃桿菌熒光顯微圖像如圖3(j)所示,在2#MBR中的含量也相對較高．這可能是由于2#MBR中有機物(投加的主要是葡萄糖)濃度相對氨氮濃度較高,有利于黃桿菌這類主要以葡萄糖作為碳源和能源,且極少能利用其他碳源生長的細菌生存[16]．

2.3 微生物群落結(jié)構(gòu)與污染物去除效果的相關(guān)性分析

表3 微生物群落結(jié)構(gòu)與污染物去除效果的相關(guān)性分析

圖3 MBR穩(wěn)定運行條件下體系中微生物熒光顯微圖像(視野放大倍數(shù)是1 000倍)

3 結(jié)論

1) 進水氨氮濃度不同的MBR經(jīng)過長時間的穩(wěn)定運行,各自形成了特有的微生物群落結(jié)構(gòu),并且相同的微生物種群在不同運行條件的MBR系統(tǒng)中的優(yōu)勢地位也不相同,變形菌是MBR主要優(yōu)勢菌群之一．

2) 高進水氨氮濃度的MBR為氨氧化細菌和硝化細菌提供了有利的生存條件,使這些細菌在MBR系統(tǒng)中大量繁殖富集,提高了MBR的硝化能力．低進水氨氮濃度的MBR限制了氨氧化細菌和硝化細菌的生存,在與其他細菌的競爭中,逐漸被淘汰,且低氨氮負荷下,MBR系統(tǒng)中存在大量的β-變形菌、放線菌、綠彎菌等絲狀菌．

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