香魚RBP基因的克隆、組織表達(dá)特征及其與鹽度應(yīng)激相關(guān)的表達(dá)分析

陳 強(qiáng)， 趙 桐， 史雨紅， 陳 炯

(寧波大學(xué)應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 寧波315211)

視黃醇結(jié)合蛋白(Retinol binding protein,RBP)最早分離自人類血漿，是脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(lipocalin)家族成員，為一種低分子量的載體蛋白[1]。RBP存在血漿和細(xì)胞內(nèi)兩種形式。血漿RBP主要是將全反式視黃醇(即維生素A,Vitamin A)及其衍生物從肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)至靶組織；細(xì)胞內(nèi)RBP參與細(xì)胞內(nèi)視黃醇的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝[2]。近來，研究發(fā)現(xiàn)RBP與脂類代謝相關(guān)，尤其是與肝酯酶(hepatic lipase,HL) 活性緊密相關(guān)[3]，而且血漿中RBP和甲狀腺素蛋白(transthyretin,TTR)的蛋白比例可作為體內(nèi)脂類代謝的生化指標(biāo)[4]。最新研究表明，RBP-視黃醇復(fù)合物通過與脂肪細(xì)胞表面受體視磺酸激活基因6(stimulated by retinoic acid 6,STRA6)結(jié)合，可激活細(xì)胞內(nèi)與脂類積累相關(guān)基因表達(dá)，如過氧化物酶體增殖物活化受體γ (peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)[5]。與哺乳動(dòng)物相比，魚類RBP研究較少，目前已有斑馬魚(Daniorerio)[6]、金頭鯛(Sparusaurata)[7]、鯉魚(Cyprinuscarpio)[8]等多種魚類RBP基因序列被測(cè)定。據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道，魚類RBP的功能主要與繁殖、胚胎發(fā)育相關(guān)[9-11]。

香魚主要分布于中國渤海、黃海、東海及臺(tái)灣省的入海溪流中，為一年生廣鹽性洄游魚類。與其它魚類相同，香魚主要由腎、鰓等組織進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)，維持組織內(nèi)特定的水分和鹽類平衡，以適應(yīng)不同鹽度的環(huán)境，因此香魚可作為研究魚類滲透壓調(diào)節(jié)機(jī)制和生理學(xué)基礎(chǔ)理論的模型。魚類鹽度應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制的研究，對(duì)提高魚類滲透壓調(diào)節(jié)能力，降低海水馴養(yǎng)或淡水馴化魚類的生產(chǎn)成本，以及在養(yǎng)殖過程中控制適宜的水體鹽度與采用合理的鹽度調(diào)節(jié)模式具有重要的經(jīng)濟(jì)意義和科學(xué)指導(dǎo)意義。

我們前期雙向電泳實(shí)驗(yàn)揭示，香魚在鹽度適應(yīng)過程中脂類代謝相關(guān)基因表達(dá)顯著變化，其中腎臟RBP表達(dá)量下降[12]。為了進(jìn)一步解析RBP在香魚鹽度應(yīng)激適應(yīng)中的作用，本文克隆了香魚RBP基因cDNA全序列，明確了其mRNA的組織表達(dá)特征，并分析了鹽度變化過程中RBP基因mRNA和血漿中蛋白表達(dá)的變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑

引物由上海英俊生物有限公司合成；總RNA抽提試劑RNAiso、文庫構(gòu)建相關(guān)試劑盒、RNAiso試劑和SYBR Premix Ex Taq試劑盒均購自Takara公司；Gel Extraction Kit 試劑盒購自O(shè)mega公司；硝酸纖維素膜(0.45μm)購自millipore公司；二抗(辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG)購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司；ECL發(fā)光試劑盒、顯影定影試劑盒、柯達(dá)X-OMAT BT膠卷購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 鹽度應(yīng)激實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)所用香魚體重80～100 g、體長(zhǎng)12～15 cm，購自寧波水產(chǎn)大世界。實(shí)驗(yàn)期間定期投喂飼料，不間斷充氣，控制水溫為20℃±1℃。實(shí)驗(yàn)設(shè)置4組：鹽度0、鹽度5、鹽度10和鹽度15，每組4條魚。在淡水中暫養(yǎng)2個(gè)星期后，咸淡水組采用3 d內(nèi)逐步升高鹽度的方式到達(dá)指定鹽度。3個(gè)星期后分別取兩組香魚的肝、脾、腎、腸、腦、心、鰓、肌肉共8個(gè)組織樣品，現(xiàn)場(chǎng)液氮速凍，-80℃冰箱保存。不同處理組香魚尾靜脈抽血后于4 ℃靜置4 h，冷凍離心取上清備用。

1.3 cDNA序列獲得及分析

根據(jù)已報(bào)道的魚類RBP保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物dRBPf(+): 5′-TGGACRG HTAYTCCTTCRTCTT-3′ (R=A,G；H=A,T,C；Y=T,C)。采用RACE技術(shù)從已構(gòu)建的香魚肝臟cDNA文庫中獲得RBP的cDNA序列。序列拼接后用BLASTX (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/BLAST/)分析。信號(hào)肽序列預(yù)測(cè)采用SignalP 4.0程序[13]。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析采用MEGA 4.0軟件[14]。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR (RT-qPCR)法檢測(cè)組織表達(dá)特征

根據(jù)香魚RBP全長(zhǎng)基因序列設(shè)計(jì)特異引物aRBP(+):5′-GATGACAGCCTCTGCCCAG-3′和aRBP(-):5′-CACAGAAACCTGTGTGTGGG-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)368 bp；內(nèi)參采用香魚β-actin看家基因，擴(kuò)增引物為pActin2 (+)5′-TCGTGCGTGACATCAAGGAG-3′和pActin2 (-): 5′-CGCACTTCATGATGCTGTTG-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)231 bp。采用RNAiso試劑提取健康香魚各組織總RNA，DNase I處理、第一鏈cDNA合成和PCR擴(kuò)增等方法同文獻(xiàn)[15]。熒光定量的結(jié)果用SPSS軟件(15.0)中的單因素方差分析法(ANOVA)進(jìn)行分析。

1.5 RT-qPCR檢測(cè)鹽度升高時(shí)RBP基因mRNA表達(dá)變化

不同鹽度應(yīng)激的組織樣本總RNA抽提、第一鏈cDNA合成，RT-qPCR的引物序列同1.4。鹽度0、鹽度5、鹽度10和鹽度15各組生物學(xué)重復(fù)n=4，技術(shù)重復(fù)3次。

1.6 原核表達(dá)、抗血清制備和Western blot分析

根據(jù)RBP基因cDNA序列設(shè)計(jì)原核表達(dá)引物pET-aRBP(+)(5′-GGAATTCGACTGTCAG GTTGCCAACAT-3′)和pET-aRBP(-)(5′-CCTCGAGTTAACTGCTCTCACAGAAAC-3′)(下劃線表示限制性內(nèi)切酶EcoR I和XhoI酶切位點(diǎn))。重組質(zhì)粒pET28a-aRBP的構(gòu)建，誘導(dǎo)表達(dá)、抗血清制備及Western blot方法同文獻(xiàn)[15]。

2 結(jié)果

2.1 香魚RBP基因cDNA序列分析

采用兩次RACE后序列拼接獲得了包含有完整閱讀框的香魚RBP序列(FN392685)。核苷酸全序列分析表明，香魚RBP基因cDNA序列長(zhǎng)為932 bp(不計(jì)polyA尾)。開放閱讀框共576 bp (58nts-633nts，含終止密碼子)，編碼一個(gè)由192個(gè)氨基酸組成的蛋白，其分子量約21.9 kDa，其等電點(diǎn)pI為6.08。前16個(gè)氨基酸殘基為信號(hào)肽序列。將香魚RBP氨基酸序列與其它已知的RBP氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，RBP一級(jí)結(jié)構(gòu)中存在有6個(gè)保守的半胱氨酸殘基，組成3對(duì)二硫鍵，在空間上形成結(jié)合——分子全反式視黃醇的位點(diǎn)[16]。序列分析表明，動(dòng)物RBP高度保守，香魚RBP與胡瓜魚(Osmerusmordax)的同源性最高，為92.7%，與大西洋鮭(Salmosalar)次之，為85.4%。

基于RBP氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，魚類RBP在進(jìn)化上緊密相關(guān)，形成一個(gè)顯著群體；兩棲類、鳥類、哺乳類動(dòng)物編碼的RBP在進(jìn)化上也緊密相關(guān)，并且物種親緣關(guān)系高的，在系統(tǒng)進(jìn)化樹中也高度相關(guān)(圖1)。

圖1 基于RBP基因氨基酸序列的NJ系統(tǒng)發(fā)生樹

分叉處數(shù)值表示1 000次重復(fù)抽樣所得到的置信度百分比,只顯示置信度60 %以上的數(shù)值; 標(biāo)尺長(zhǎng)度表明每個(gè)位點(diǎn)發(fā)生0.1次置換。所用序列登錄號(hào)為:香魚(FN392685),胡瓜魚(BT075450),大西洋鮭(BT048297),虹鱒(AF538329),斑馬魚(NM_130920),金頭鯛(AF083556),白斑狗魚(BT079072),鯉魚 (AJ277123),黑青斑東方鲀(CAAE01015106),雞(NM_205238),馬蘇麻哈魚(EU325861),人(AL356214),牛(BC109815),豬(NM_214057),小鼠(NM_011255),非洲爪蟾(J02718),歐洲海鱸(FQ310507),藍(lán)鯰(GU588259),尼羅羅非魚(XM_003441859),褐石斑魚(JF501991),斜帶石斑魚(FJ438490)。

2.2 香魚RBP基因 mRNA的組織表達(dá)特征分析

RT-qPCR分析結(jié)果顯示，RBP基因mRNA在肝臟中表達(dá)量最高，腎、腸、腦和鰓表達(dá)次之，肌肉中表達(dá)量相對(duì)較少，而脾和心中幾乎不表達(dá)(圖2)。

2.3 香魚RBP基因在鹽度升高時(shí)mRNA表達(dá)量變化

選取對(duì)照香魚中表達(dá)RBP基因mRNA的肝、腎、腦、鰓和腸組織進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)。RT-qPCR結(jié)果表明，5個(gè)組織中RBP基因mRNA表達(dá)量呈不同程度下降趨勢(shì)(圖3)。腦組織的表達(dá)量無顯著性變化；肝和腸組織中表達(dá)量在鹽度15時(shí)，有顯著下降(P<0.05)，分別下降至鹽度0時(shí)的0.59倍和0.48倍；腎和鰓組織中鹽度下降表達(dá)量變化最顯著(P<0.01)，腎組織中鹽度升高時(shí)，表達(dá)量分別下降至鹽度0時(shí)的0.51倍、0.08倍和0.05倍，鰓組織中表達(dá)分別下降為鹽度為0時(shí)的0.53倍、0.24倍和0.06倍。

圖2 RT-qPCR分析RBP mRNA在香魚組織中的表達(dá)情況

圖3 鹽度升高時(shí)香魚肝、腎、腦、鰓、腸中RBP 基因mRNA表達(dá)量變化

圖4 香魚RBP基因的原核表達(dá)(a)和Western blot檢測(cè)(b)

2.4 香魚RBP基因的原核表達(dá)和抗血清制備

測(cè)序驗(yàn)證正確的表達(dá)載體pET28a-aRBP在大腸桿菌BL21 Plys E中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳分離得到一條表達(dá)量很高的蛋白條帶，相對(duì)分子質(zhì)量約為24.1 kDa，與預(yù)計(jì)大小(RBP成熟肽20.3 kDa+融合蛋白3.8 kDa)相近 (圖4a)。該片段切膠純化后免疫小鼠，制備抗血清。用Western blot對(duì)獲得的抗血清進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果抗血清具有很高特異性(圖4b)，可以用于香魚RBP蛋白含量變化檢測(cè)。

2.5 Western blot檢測(cè)香魚RBP在血清中含量的變化

取不同鹽度處理組香魚血清進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果表明，隨鹽度升高，香魚血清RBP表達(dá)量逐漸下降，鹽度5時(shí)為鹽度0時(shí)的0.71倍，鹽度10時(shí)為鹽度0時(shí)的0.57倍(P< 0.05) ，鹽度15時(shí)是鹽度0時(shí)的0.26倍(P< 0.01) (圖5)。

圖5 鹽度升高時(shí)香魚血清RBP 表達(dá)量變化

3 討論

在本研究中，我們克隆并測(cè)定了香魚RBP基因的cDNA序列，其長(zhǎng)度為932bp，開放閱讀框由192個(gè)氨基酸組成，N端具有信號(hào)肽。香魚RBP與其他已報(bào)道的魚類RBP高度相似，不同物種RBP基因的親緣關(guān)系與物種進(jìn)化吻合。RBP在其它組織中少量表達(dá)，但主要還是在肝臟中表達(dá)并釋放到血清中而進(jìn)入各種組織，這與已發(fā)表文獻(xiàn)報(bào)道一致[8]。

當(dāng)環(huán)境鹽度改變時(shí)，機(jī)體需要消耗大量的能量來調(diào)節(jié)體內(nèi)滲透壓和離子平衡[17]。文獻(xiàn)報(bào)道，小鋸蓋魚(Centropomusparallelus,fat snook)在鹽度30時(shí)，主要以脂類物質(zhì)代謝為主要能量代謝形式，以適應(yīng)高鹽環(huán)境[18]。香魚在鹽度升高時(shí)腎臟中脂類代謝基因表達(dá)顯著變化[12]。由此說明魚類在適應(yīng)鹽度變化過程中，脂類代謝加強(qiáng)以提供離子主動(dòng)運(yùn)輸所需的能量。RBP參與脂類代謝，一方面是由于視黃醇類物質(zhì)參與調(diào)節(jié)脂類代謝，包括肝臟和腸甘油三酯的合成和分泌、脂肪酸beta-氧化和脂蛋白C-III合成等[19]。另一方面RBP被認(rèn)為是新型脂肪細(xì)胞因子(adipokine)，與脂類物質(zhì)代謝直接相關(guān)。RBP-視黃醇復(fù)合物可作為信號(hào)分子作用于脂肪細(xì)胞表面受體STRA6，導(dǎo)致胞內(nèi)PPARγ基因的表達(dá)[5]，而PPARγ基因能調(diào)節(jié)脂類代謝靶基因的表達(dá)，降低血脂水平，限制甘油三酯分解，促進(jìn)成熟脂肪細(xì)胞中脂肪酸的吸收和儲(chǔ)存，加速脂肪沉積[20,21]。本研究表明，鹽度升高時(shí)，肝臟、腎、鰓和腸RBP基因mRNA表達(dá)量呈不同程度下降趨勢(shì)，并且血漿中RBP蛋白也顯著下降。我們推測(cè)由于RBP的減少，RBP-視黃醇復(fù)合物減少，導(dǎo)致STRA6介導(dǎo)的信號(hào)通路失效，PPARγ基因的表達(dá)受阻，有利于血脂水平的升高和脂肪動(dòng)員，提高機(jī)體能量代謝水平。

綜上所述，本研究報(bào)道了香魚RBP基因的克隆及序列分析，并探討了其表達(dá)與環(huán)境鹽度應(yīng)激的相關(guān)性，為后續(xù)蛋白功能的研究奠定了基礎(chǔ)，并有助于了解洄游性魚類鹽度適應(yīng)的分子機(jī)理。

[1]Kanai M,Raz A,Goodman D S. Retinol-binding protein: the transport protein for vitamin A in human plasma [J]. J Clin Invest,1968,47(9): 2025-2044.

[2]Bellovino D,Apreda M,Gragnoli S,et al. Vitamin A transport: in vitro models for the study of RBP secretion [J]. Mol Aspects Med,2003,24(6): 411-420.

[3]von Eynatten M,Lepper P M,Liu D,et al. Retinol-binding protein 4 is associated with components of the metabolic syndrome,but not with insulin resistance,in men with type 2 diabetes or coronary artery disease [J]. Diabetologia,2007,50(9): 1930-1937.

[4]Henze A,Frey S K,Raila J,et al. Alterations of retinol-binding protein 4 species in patients with different stages of chronic kidney disease and their relation to lipid parameters [J]. Biochem Biophys Res Commun,2010,393(1): 79-83.

[5]Berry D C,Noy N. Signaling by vitamin A and retinol-binding protein in regulation of insulin responses and lipid homeostasis [J]. Biochim Biophys Acta,2012,1821(1): 168-176.

[6]Sammar M,Babin P J,Durliat M,et al. Retinol binding protein in rainbow trout: molecular properties and mRNA expression in tissues [J]. Gen Comp Endocrinol,2001,123(1): 51-61.

[7]Funkenstein B. Developmental expression,tissue distribution and hormonal regulation of fish (Sparusaurata) serum retinol-binding protein [J]. Comp Biochem Physiol Part B: Biochem Mol Biol,2001,129(2-3): 613-622.

[8]Bellovino D,Morimoto T,Apreda M,et al. Isolation,expression and characterization of carp retinol-binding protein [J]. Gene,2002,295(2): 231-240.

[9]Sammar M,Levi L,Hurvitz A,et al. Studies on retinol-binding protein during vitellogenesis in the Rainbow Trout (Oncorhynchusmykiss) [J]. Gen Comp Endocrinol,2005,141(2): 141-151.

[10]Levi L,Levavi-Sivan B,Lubzens E. Expression of genes associated with retinoid metabolism in the trout ovarian follicle[J]. Biol Reprod,2008,79(3): 570-577.

[11]Belliveau D J,Venkatachalam A B,Thisse C,et al. The duplicated retinol-binding protein 7 (rbp7) genes are differentially transcribed in embryos and adult zebrafish (Daniorerio) [J]. Gene Expr Patterns,2010,10(4-5): 167-176.

[12]Chen J,Wu H Q,Shi Y H,et al. The effects of environmental salinity on trunk kidney proteome of juvenile ayu (Plecoglossusaltivelis) [J]. Comp Biochem Physiol Part D: Genomics Proteomics,2009,4(4): 263-267.

[13]Petersen T N,Brunak S,von Heijne G,et al. Signal P 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions[J]. Nat Methods,2011,8(10): 785-786.

[14]Tamura K,Dudley J,Nei M,et al. MEGA4: molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0 [J]. Mol Biol Evol,2007,24(8): 1596-1599.

[15]黃左安,陳 炯,陸新江,等. 香魚凝血因子X 基因表達(dá)與鰻利斯頓氏菌感染的相關(guān)性 [J]. 動(dòng)物學(xué)研究,2011,32(5): 492-498.

[16]Colantuoni V,Romano V,Bensi G,et al. Cloning and sequencing of a full length cDNA coding for human retinol-binding protein [ J ]. Nucleic Acids Res,1983,11 (22): 7769-7776.

[17]Tseng Y C,Hwang P P. Some insights into energy metabolism for osmoregulation in fish [J]. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol,2008,148(4): 419-429.

[18]Rocha A J,Gomes V,Ngan P V,et al. Effects of anionic surfactant and salinity on the bioenergetics of juveniles ofCentropomusparallelus(Poey) [J]. Ecotoxicol Environ Saf,2007,68(3),397-404.

[19]Staels B. Regulation of lipid and lipoprotein metabolism by retinoids [ J ]. J Am Acad Dermatol,2001,45(5): S158-S167.

[20]Schadinger S E,Bucher N L,Schreiber B M,et al. PPARγ2 regulates lipogenesis and lipid accumulation in steatotic hepatocytes [J]. Am J Physiol Endocrinol Metab,2005,288(6): 1195-1205.

[21]Xu C,Wang L L,Liu H Y,et al. A novel dual peroxisome proliferator-activated receptors and agonist with beneficial effects on insulin resistance and lipid metabolism [J]. Biotechnol Lett,2006,28(12): 863-868.