FISH技術(shù)解析不同氨氮濃度MBR中的微生物群落結(jié)構(gòu)

楊小麗 周 娜 陳 明 張 瑞 宋海亮 傅大放

(1東南大學(xué)土木工程學(xué)院,南京 210096)

(2東南大學(xué)能源與環(huán)境學(xué)院,南京 210096)

膜生物反應(yīng)器(membrane bioreactor,MBR)是將生物處理與膜分離技術(shù)有機(jī)結(jié)合起來(lái)的一種新型污水處理技術(shù)．由于膜組件的高效截留作用,MBR實(shí)現(xiàn)了水力停留時(shí)間(HRT)和污泥齡(SRT)的完全分離,有利于世代周期較長(zhǎng)的硝化細(xì)菌的富集增長(zhǎng),使MBR硝化效率增強(qiáng),但目前對(duì)不同硝化強(qiáng)度下MBR中起主要作用的微生物群落結(jié)構(gòu)的變化研究仍較有限[1]．近年來(lái),隨著PCR,SSCP,FISH等現(xiàn)代分子生物技術(shù)的發(fā)展,使得快速準(zhǔn)確地鑒定細(xì)菌成為可能．在水處理微生物學(xué)中,已經(jīng)開(kāi)始廣泛應(yīng)用現(xiàn)代生物學(xué)分子技術(shù)檢測(cè)處理體系中微生物群落生態(tài)演替規(guī)律及種群數(shù)量的波動(dòng)等．其中,FISH是應(yīng)用廣泛、最為有效的技術(shù)之一．

為了探究不同硝化過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)的組成變化,本文應(yīng)用FISH技術(shù)對(duì)不同氨氮負(fù)荷的MBR進(jìn)行微生物種群檢測(cè)．根據(jù)文獻(xiàn)[2-3],本文選擇了污水處理中常見(jiàn)的8種細(xì)菌并對(duì)其數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)分析,分別是:變形菌(α-變形菌(Alphaproteobacteria)、β-變形菌(Betaproteobacteria)、γ-變形菌(Gammaproteobacteria))、放線菌、黃桿菌、綠彎菌、氨氧化細(xì)菌、硝化細(xì)菌．通過(guò)研究,以期真實(shí)反映出在不同進(jìn)水氨氮濃度的MBR中微生物群落結(jié)構(gòu)的組成變化,同時(shí)分析其數(shù)量分布及豐度,探索MBR中微生物菌群結(jié)構(gòu)與硝化作用的內(nèi)在關(guān)系,為實(shí)際工程進(jìn)一步提高M(jìn)BR的處理效果提供理論依據(jù)．

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置

MBR實(shí)驗(yàn)裝置如圖1所示．

圖1 MBR實(shí)驗(yàn)裝置示意圖

1.2 熒光原位雜交技術(shù)實(shí)驗(yàn)步驟

熒光原位雜交技術(shù)實(shí)驗(yàn)步驟如下：① 進(jìn)行玻片預(yù)處理、樣品采集與預(yù)處理[4]．② 雜交反應(yīng).在密閉的雜交盒中放入吸水紙,用不含探針的雜交液(SDS 0.1%,Tris-HCl (pH 8.0) 20 mmol/L,甲酰胺濃度見(jiàn)表1)潤(rùn)濕．用移液槍分別取24 μL雜交液和1 μL探針溶液放入帶有樣品的載玻片上,然后放入雜交盒內(nèi)進(jìn)行雜交反應(yīng)．總細(xì)菌和硝化細(xì)菌雜交時(shí)間為5 h,其余為2～3 h,雜交溫度均為46 ℃．所有有關(guān)探針的操作應(yīng)避光處理．③ 洗脫反應(yīng).提前將洗脫液(EDTA 56 mmol/L,SDS 0.1%,Tris-HCl (pH 8.0) 20 mmol/L,NaCl濃度根據(jù)雜交液中甲酰胺濃度確定)放入水浴鍋中48 ℃預(yù)熱,然后倒入干燥的雜交盒;將載玻片放入裝有洗脫液的雜交盒中,避光密閉洗脫20 min后除去洗脫液,用ddH2O漂洗2次．④ DAPI染色.取10 μL濃度為1 μg/mL的DAPI加到載玻片樣品上,染色5 min,用甲醇漂洗,加上蓋玻片,用封片劑封片,放在室溫下晾干．

表1 實(shí)驗(yàn)使用的16S和23S rRNA特異寡核苷酸探針序列

待載玻片干燥后,立即使用OLYMPUS-BX41熒光顯微鏡觀察．該熒光顯微鏡配置有3種不同波長(zhǎng)的濾光片,分別為:395～415 nm,420～485 nm,460～550 nm．觀測(cè)30個(gè)視野,用Image-Pro Plus 6.0軟件讀取細(xì)菌數(shù)目．對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行了3組平行實(shí)驗(yàn)．觀察時(shí)每組實(shí)驗(yàn)至少攝取30個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后將3組平行樣的計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行平均計(jì)算[8]．

本實(shí)驗(yàn)所使用的靶向細(xì)菌、序列、雜交條件詳見(jiàn)表1．其中探針NIT3用FITC標(biāo)記,激發(fā)光為亮綠色;其余探針用HEX標(biāo)記,激發(fā)光為紅色．

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 MBR對(duì)污染物的去除效果

表2 MBR對(duì)COD和的平均去除效果(n=33)

2.2 MBR微生物群落結(jié)構(gòu)

圖2為3個(gè)MBR中細(xì)菌的構(gòu)成比較．由圖可看出,3個(gè)MBR中,所選細(xì)菌涵蓋細(xì)菌總量的90%～97%,說(shuō)明所選細(xì)菌具有很好的代表性[12]．在1#MBR中α-變形菌和β-變形菌相對(duì)系統(tǒng)中其他細(xì)菌來(lái)說(shuō)含量較多,占總細(xì)菌的比例分別為18%和21%;其次是氨氧化細(xì)菌、硝化細(xì)菌、γ-變形菌和綠彎菌,分別占總細(xì)菌的15%,13%,12%和10%;放線菌和黃桿菌相對(duì)來(lái)說(shuō)含量較低,均不超過(guò)6%;另外,3%的細(xì)菌未檢測(cè)出．Zang等[13]采用FISH方法測(cè)試了活性污泥中的優(yōu)勢(shì)菌群，得出類似的結(jié)果:α-變形菌和β-變形菌占總細(xì)菌的比例均為20%左右；黃桿菌和放線菌相對(duì)含量為6%～10%．在2#MBR中優(yōu)勢(shì)菌群是β-變形菌,占總細(xì)菌數(shù)量的比例為24%;其次是α-變形菌、放線菌、黃桿菌和綠彎菌,占總細(xì)菌的比例為15%左右;其余細(xì)菌所占比例均不大于5%．在3#MBR中氨氧化細(xì)菌為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌種,占總細(xì)菌的26%;其次是α-變形菌、硝化細(xì)菌和β-變形菌,所占比例分別為19%,17%和16%;其他細(xì)菌所占比例約為2%～5%．以上結(jié)果表明,不同進(jìn)水氨氮濃度的MBR經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定運(yùn)行后,形成了各自特定的微生物群落結(jié)構(gòu),相同的微生物種群在不同的MBR體系中的優(yōu)勢(shì)地位不同．

圖2 3個(gè)MBR中細(xì)菌的構(gòu)成比較

從圖2中還可看出,變形菌在3個(gè)MBR中占總細(xì)菌的比例分別是51%,44%,39%,可見(jiàn)變形菌在MBR微生物群落結(jié)構(gòu)中占有明顯優(yōu)勢(shì)．張斌等[14]采用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)處理不同廢水MBR體系中的微生物群落結(jié)構(gòu)比較也發(fā)現(xiàn),變形菌是MBR的主要優(yōu)勢(shì)菌落．

圖3是MBR中微生物的熒光顯微圖像．圖3(f)為綠彎菌,在3個(gè)MBR中含量均比較少．Bj?rnsson等[10]實(shí)驗(yàn)證明,綠彎菌確實(shí)是活性污泥的組成成分之一．在活性污泥系統(tǒng)中綠彎菌是生活在好氧環(huán)境下的,主要以糖類為基質(zhì)[15-16]，因此較低氨氮負(fù)荷的MBR更有利于綠彎菌的生存．Kragelund等[16]應(yīng)用MAR-FISH技術(shù)對(duì)126座生活污水和工業(yè)廢水處理廠進(jìn)行的綠彎菌檢測(cè)表明,50%的污水廠中檢測(cè)到了綠彎菌,其中12%的污水廠中綠彎菌含量比較高,而且是造成污泥膨脹的主要絲狀細(xì)菌之一．

圖3(g)、(h)在同一個(gè)視野下拍攝的,圖3(g)是2#MBR的熒光顯微圖像,圖3(h)是2#MBR β-變形菌的DAPI圖像,箭頭指向的是該探針檢測(cè)到的β-變形菌．由圖可看到,這種細(xì)菌在2#MBR中呈絲狀大量分布．此時(shí)，2#MBR中放線菌和綠彎菌較其他2個(gè)MBR含量增多,與2#MBR呈現(xiàn)污泥膨脹的態(tài)勢(shì)相吻合．由此表明,低氨氮負(fù)荷的MBR在長(zhǎng)期穩(wěn)定運(yùn)行中更易發(fā)生污泥膨脹,絲狀β-變形菌是引起污泥膨脹的主要絲狀細(xì)菌之一．

黃桿菌熒光顯微圖像如圖3(j)所示,在2#MBR中的含量也相對(duì)較高．這可能是由于2#MBR中有機(jī)物(投加的主要是葡萄糖)濃度相對(duì)氨氮濃度較高,有利于黃桿菌這類主要以葡萄糖作為碳源和能源,且極少能利用其他碳源生長(zhǎng)的細(xì)菌生存[16]．

2.3 微生物群落結(jié)構(gòu)與污染物去除效果的相關(guān)性分析

表3 微生物群落結(jié)構(gòu)與污染物去除效果的相關(guān)性分析

圖3 MBR穩(wěn)定運(yùn)行條件下體系中微生物熒光顯微圖像(視野放大倍數(shù)是1 000倍)

3 結(jié)論

1) 進(jìn)水氨氮濃度不同的MBR經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定運(yùn)行,各自形成了特有的微生物群落結(jié)構(gòu),并且相同的微生物種群在不同運(yùn)行條件的MBR系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)地位也不相同,變形菌是MBR主要優(yōu)勢(shì)菌群之一．

2) 高進(jìn)水氨氮濃度的MBR為氨氧化細(xì)菌和硝化細(xì)菌提供了有利的生存條件,使這些細(xì)菌在MBR系統(tǒng)中大量繁殖富集,提高了MBR的硝化能力．低進(jìn)水氨氮濃度的MBR限制了氨氧化細(xì)菌和硝化細(xì)菌的生存,在與其他細(xì)菌的競(jìng)爭(zhēng)中,逐漸被淘汰,且低氨氮負(fù)荷下,MBR系統(tǒng)中存在大量的β-變形菌、放線菌、綠彎菌等絲狀菌．

)

[1]Judd S J. The status of membrane bioreactor technology[J].TrendsinBiotechnology, 2008,26(2): 109-116.

[2]Amann R, Fuchs B M. Single-cell identification in microbial communities by improved fluorescence in situ hybridization techniques[J].NatureReviewsMicrobiology, 2008,6(5): 339-348.

[3]Snaidr J, Amann R, Huber I, et al. Phylogenetic analysis and in situ identification of bacteria in activated sludge[J].AppliedandEnvironmengtalMicrobiology, 1997,59(1): 143-169.

[4]朱琳,尹立紅,浦躍樸,等. 熒光原位雜交法檢測(cè)環(huán)境硝化細(xì)菌實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化及應(yīng)用[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版, 2005, 35(2): 266-270.

Zhu Lin, Yin Lihong, Pu Yuepu, et al. Optimization and application of fluorescence in situ hybridization assay for detecting nitrifying bacteria in environmental samples[J].JournalofSoutheastUniversity:NaturalScienceEdition, 2005,35(2): 266-270.(in Chinese)

[5]Britt-Marie W, Motoharu O, Malte H, et al. Microbial community structure in activated sludge floc analysed by fluorescence in situ hybridization and its relation to floc stability [J].WaterResearch, 2008,42(8): 2300-2308.

[6]He Shuying, Chen Jing, Li Jixiang. Dynamics of Nitrobacteria community in biological contact oxidation process by DGGE and FISH[C]//4thInternationalConferenceonBioinformaticsandBiomedicalEngineering. Chengdu, China, 2010: 5515470.

[7]Lubarsky H V, Hubas C, Chocholek M, et al. The stabilisation potential of individual and mixed assemblages of natural bacteria and microalgae[J].PLoSone, 2010,5(11): 1-12.

[8]Manz W, Amann R, Ludwig W, et al. Application of a suite of 16S rRNA specific oligonucleotide probes designed to investigate bacteria of the phylum Cytophaga-Flavobacter-Bacteroides in the natural environment[J].Microbiology,1996,142(5): 1097-1106.

[9]Bj?rnsson L, Hugenholtz P, Tyson G W, et al. Filamentous Chloroflexi (green non-sulfur bacteria) are abundant in wastewater treatment processes with biological nutrient removal[J].Microbiology, 2002,148(8): 2309-2318.

[10]Roller C, Wagner M, Amann R, et al. In situ probing of Gram-positive bacteria with high G+C content using 23S rRNA-targeted oligonucleotides[J].Microbiology, 1994,140(10): 2849-2858.

[11]楊宗政,顧平,劉靜文.好氧序批式MBR處理高濃氨氮廢水[J].中國(guó)給水排水,2005,21(3):53-56.

Yang Zongzheng, Gu Ping, Liu Jingwen. Aerobic sequencing MBR for treatment high concentration of ammonia nitrogen wastewater[J].ChinaWater&Wastewater, 2005,21(3): 53-56. (in Chinese)

[12]Zang K, Kurisu F, Kasuga I, et al. Analysis of the phylogenetic diversity of estrone-degrading bacteria in activated sewage sludge using microautoradiography-fluorescence in situ hybridization[J].SystematicandAppliedMicrobiology, 2008,31(3): 206-214.

[13]Mota C, Head M A, Ridenoure J A, et al. Effects of aeration cycles on nitrifying bacterial populations and nitrogen removal in intermittently aerated reactors[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology, 2005,71(12): 8565-8572.

[14]張斌,孫寶盛,劉慧娜,等. 處理不同廢水MBR系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)的比較[J].環(huán)境科學(xué), 2008,29(10): 2943-2949.

Zhang Bin, Sun Baosheng, Liu Huina, et al. Comparison of microbial community structure in MBRs treating different wastewater[J].EnvironmentalScience, 2008,29(10): 2943-2949. (in Chinese)

[15]Kragelund C, Kong Y, Thelen K, et al. Ecophysiology of different filamentous Alphaproteobacteria species from industrial waste water treatment plants[J].Microbiology, 2006,152(10): 3003-3012.

[16]馬迪根M T, 馬丁克J M.BROCK微生物生物學(xué):上冊(cè)[M].11版.李春明,楊文博,譯.北京:科學(xué)出版社,2009:592-593.

[17]高大文,李昕芯,安瑞,等.不同DO下MBR內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)與運(yùn)行效果關(guān)系[J].中國(guó)環(huán)境科學(xué),2010,30(2):209-215.

Gao Dawen, Li Xinxin, An Rui,et al. Relationships between microbial community structure and the performance of MBR under different dissolved oxygen[J].ChinaEnvironmentalScience, 2010,30(2): 209-215. (in Chinese)