HPLC法測(cè)定平胃散中聚乙炔類成分

徐敬儒 劉玉強(qiáng) 才 謙

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連 116600

平胃散最早記載于《簡(jiǎn)要濟(jì)眾方》，后完備于《太平惠民和劑局方》卷3[1]，其功效燥濕健脾，行氣和胃。主治濕困脾胃癥。處方由君藥蒼術(shù)（麩炒）配以厚樸（姜炙）、陳皮、甘草4味組成，為全面提高藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，保證臨床用藥安全、有效，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)平胃散中的蒼術(shù)素和（4E,6E,12E）-十四癸三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯兩種聚乙炔類成分進(jìn)行了含量測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 儀器

手提式粉碎機(jī)（浙江中藥機(jī)械有限公司）；Sartorius CP225D型電子天平（十萬(wàn)分之一，德國(guó)Sartorius公司）；AR2140電子分析天平（上海奧豪斯公司）；KH-300P型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；高效液相色譜儀為Angilent 1100系列：四元泵、在線脫氣機(jī)、柱溫箱、Angilent 1100化學(xué)工作站；Promosil C18（4.6mm×250mm,5μm）色譜柱（Bonna-Agela technologies）。

1.2 試劑和藥材

蒼術(shù)素和(4E,6E,12E)-十四癸三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯峰對(duì)照品（上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心，純度大于98%）；乙腈(色譜純，瑞典歐森巴克化學(xué)公司)；甲醇(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；其余試劑均為分析純；蒼術(shù)（麩炒）、厚樸（姜炙）、陳皮、甘草（炙）均購(gòu)自北京同仁堂大藥房大連分店，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)鑒定教研室李峰教授鑒定，均符合《中國(guó)藥典》規(guī)定。

2 方法

2.1 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取蒼術(shù)素和（4E，6E，12E）-十四癸三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯峰對(duì)照品適量，加甲醇配成質(zhì)量濃度分別為497mg/L和502mg/L的儲(chǔ)備液；不同濃度的對(duì)照品溶液的配制均用以上儲(chǔ)備液混合并用甲醇稀釋，定容，微孔濾膜（0.45μm）濾過(guò)，即得對(duì)照品混合溶液。以上溶液均密封避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 供試品溶液的制備

取蒼術(shù)24g，厚樸18g，陳皮12g，甘草6g，四種藥材混合粉碎(過(guò)60目篩)去，取約0.5g，精密稱定，置于具賽錐形瓶中，加入甲醇20mL，密塞，超聲提取60min，取出，放至室溫后濾過(guò)，濾液經(jīng)減壓旋蒸濃縮后，移至5mL量瓶中，用甲醇定容至刻度線，搖勻，靜置。取溶液過(guò)0.45μm微孔濾膜，作為供試品溶液備用，整個(gè)過(guò)程要求避光。

2.3 陰性液的制備

取厚樸18g，陳皮12g，甘草6g，三種藥材混合粉碎(過(guò)60目篩)去，取約0.5g，精密稱定，置于具賽錐形瓶中，加入甲醇20mL，密塞，超聲提取60min，取出，放至室溫后濾過(guò)，濾液經(jīng)減壓旋蒸濃縮后，移至5mL量瓶中，用甲醇定容至刻度線，搖勻，靜置。取溶液過(guò)0.45μm微孔濾膜，作為陰性對(duì)照溶液備用，整個(gè)過(guò)程要求避光。

2.4 色譜條件

色譜柱 promosll-C18（4.6mm×250mm,5μm）；流速：1.0mL/min，柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：340 nm；進(jìn)樣量為20μl；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫程序：48%A（8min）-54%A（7 min）-85%A（13 min）。理論塔板數(shù)以蒼術(shù)素計(jì)不低于8000，以（4E,6E,12E）-十四癸三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯峰計(jì)不低于8000。

3 結(jié)果

3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

取陰性對(duì)照溶液、二合一對(duì)照品溶液和供試品溶液，按2.4項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，其色譜圖如圖1所示陰性樣品溶液在蒼術(shù)素與（4E，6E，12E）-十四癸三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯對(duì)應(yīng)保留時(shí)間的出峰位置處無(wú)干擾。色譜圖，見圖1。

圖1 陰性對(duì)照品、二合一對(duì)照品和樣品的HPLC圖譜

3.2 線性關(guān)系考查

精密吸取蒼術(shù)素和(4E,6E,12E)-十四癸三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯峰對(duì)照品溶液適量，加甲醇配制成不同濃度的溶液，按2.4項(xiàng)下所述色譜條件下，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積積分值縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，結(jié)果見表1。

表1 兩種聚乙烯類成分的準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

3.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液20μL，按2.3項(xiàng)下所述色譜條件下進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣6次，蒼術(shù)素峰面積的RSD為1.5%（n=6）；（4E，6E，12E）- 十四癸三烯 -8,10- 二炔 -1,3- 二乙酸酯峰面積的RSD為1.7%（n=6）。

3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液20μL，按2.3項(xiàng)下所述色譜條件下進(jìn)樣，分別在 0、4、8、12、24、36 h 注入液相色譜儀測(cè)定，蒼術(shù)素峰面積峰面積的RSD為2.4%（n=6）；（4E，6E，12E）-十四癸三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯峰面積的RSD為3.7%（n=6）。表明供試品溶液在36h內(nèi)穩(wěn)定。

3.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)藥材粉末，平行稱定6份，按2.2項(xiàng)下所述方法制備供試品溶液，按2.4項(xiàng)下所述色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)定峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果表明，樣品中蒼術(shù)素的平均質(zhì)量 分 數(shù) 為 1.45mg/g，RSD為 2.8%（n=6）；（4E，6E，12E）-十四癸三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.88mg/g，峰面積的RSD為3.6%（n=6）。

3.6 加樣回收率試驗(yàn)

取已測(cè)定含量的平胃散藥材粉末約0.25g，精密稱定6份，加入適量對(duì)照品，按2.2項(xiàng)下所述方法制備供試品溶液，按2.4項(xiàng)下所述色譜條件下進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積并計(jì)算含量、回收率和RSD，結(jié)果見表2。

表2 平胃散中2種聚乙炔類化合物回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=5）

3.7 樣品含量測(cè)定

取平胃散藥材粉末6批，按2.2項(xiàng)下所述方法制備供試品溶液，按2.4項(xiàng)下所述色譜條件下進(jìn)樣分析，計(jì)算蒼術(shù)素和（4E，6E，12E）-十四癸三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯的含量，結(jié)果見表3。采用本法測(cè)得（4E，6E，12E）-十四癸三烯-8，10-二炔-1，3-二乙酸酯的平均含量2.823mg/g，蒼術(shù)素的平均含量1.444mg/g。

表3 平胃散中2種聚乙炔類化合物的含量（mg/g，n=6）

4 討論

蒼術(shù)素、蒼術(shù)素醇和（4E，6E，12E）-十四癸三烯-8,10-二炔-1，3-二乙酸酯均屬于聚乙炔類化合物，且該類化合物在利膽、抗炎、消化道系統(tǒng)以及阻礙黃嘌呤氧化酶等方面體現(xiàn)良好活性[2-3]。該類化合物主要存在于蒼術(shù)中，含量較高，同屬植物白術(shù)中幾乎不含有該類成分[4]，且已有利用HPLC法測(cè)定二妙丸中蒼術(shù)素含量的相關(guān)研究[5]，故選用聚乙炔類化合物作為以蒼術(shù)為君藥的復(fù)方制劑平胃散的專屬性測(cè)定成分具有合理性，但因蒼術(shù)素醇化學(xué)性質(zhì)較不穩(wěn)定，易分解，因此以蒼術(shù)素和（4E，6E，12E）-十四癸三烯-8,10-二炔-1，3-二乙酸酯為指標(biāo)，建立其含量測(cè)定方法更為合理。

供試品制備曾分別以甲醇超聲0.5、1、2h，結(jié)果采用超聲1h和2h提取的聚乙炔類含量較完全，且結(jié)果相差不大，故選用以甲醇超聲提取，同時(shí)考察發(fā)現(xiàn)超聲1h有效成分方可提取完全，故確定此提取時(shí)間。

在波長(zhǎng)選擇過(guò)程中，將（4E，6E，12E）-十四癸三烯-8、10-二炔-1、3-二乙酸酯對(duì)照品溶于甲醇中，測(cè)定其紫外光譜，發(fā)現(xiàn)在320nm附近有較大吸收，紫外光譜圖見圖2。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，蒼術(shù)素的最大吸收波長(zhǎng)為340nm[6-7]，且參考中國(guó)藥典[8]規(guī)定蒼術(shù)素的檢測(cè)波長(zhǎng)為340nm，為方便檢測(cè)，故最終確定檢測(cè)波長(zhǎng)為340nm。

流動(dòng)相選擇上，由于平胃散成分較為復(fù)雜，對(duì)液相檢測(cè)有較大干擾，本實(shí)驗(yàn)先后比較了乙腈-水( 70∶30) 、甲醇-水（79∶21）等不同比例等度洗脫，結(jié)果表明等度洗脫很難保證在相對(duì)較短的保留時(shí)間內(nèi)使兩種聚乙炔類化合物達(dá)到較高的分離度，故采用梯度洗脫，其優(yōu)點(diǎn)在于：色譜峰分離度好，保留時(shí)間適中。

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[4] 陳炎明，侴貴新，王崢濤.反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定蒼術(shù)中的兩種聚乙炔類化合物 [J].色譜，2007，1（25）：84-87.

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