5個溫郁金居群遺傳多樣性的RAPD分析

陶銀龍 王佐元 丁文勇 鄭蔚虹

(溫州大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州325035)

溫郁金(Curcumawenyujin)為姜科(Zingiberaceae)姜黃屬(Curcuma)，多年生草本植物，是著名的“浙八味”之一.溫郁金在宋朝《證類本草》(公元1108年前)中即有記載，因產(chǎn)于浙江溫州而得名，素有溫州逢莪術(shù)之稱，至今已有近千年的種植歷史。由于人類無節(jié)制的采挖，野生溫郁金幾乎絕跡，被浙江省列為重點保護物種。目前市面上見到的溫郁金為人工栽培品種，主要種植于瑞安的陶山、荊谷、碧山、馬嶼及樂清的四都和平陽的梅源一帶。溫郁金是一種以根和莖兩部位均可入藥的藥材，具有很高的藥用價值，可加工成3種功效不一的藥材：塊根煮透，曬干稱為“溫郁金”；根莖煮透，曬干為“溫莪術(shù)”；根莖縱切成片，曬干后為“片姜黃”.[1-2]調(diào)查顯示，目前溫郁金種植面積不斷增加，但連年出現(xiàn)未成熟葉子就枯黃的現(xiàn)象(主要在陶山沙洲)，導(dǎo)致減產(chǎn)，嚴重的甚至絕收.初步了解，造成溫郁金減產(chǎn)和絕收的主要原因有：(1)溫郁金的生長環(huán)境受到污染，已不利于其生長；(2)長期的人工種植，種質(zhì)發(fā)生了退化，使得一些優(yōu)良性狀遺失.此外，過多的使用化肥和農(nóng)藥在一定程度上也影響溫郁金的產(chǎn)量.

植物的遺傳多樣性是品種遺傳改良的基礎(chǔ).DNA分子標記能客觀、較準確地檢測作物基因組DNA水平的差異.各種DNA分子標記在群體中都有足夠頻率的等位性變異，利用分子標記技術(shù)可以評價和描述相關(guān)品種多樣性及親緣關(guān)系的遠近，從而達到種質(zhì)資源鑒定的目的.目前，DNA分子標記已在水稻、小麥和大豆等農(nóng)作物的種質(zhì)資源鑒定中得到了廣泛應(yīng)用[3].分子標記的應(yīng)用為植物育種學(xué)開辟了新的研究和應(yīng)用領(lǐng)域，它使植物育種學(xué)家能直接從分子水平了解種間的差異，可使人們在育種篩選過程中節(jié)省時間及大量的人力、物力和財力[4-5].

1990年，由Williams[6]和Welsh[7]帶領(lǐng)的兩個研究小組在PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈式反應(yīng))的基礎(chǔ)上，同時首次運用隨機引物擴增多態(tài)性DNA片段作為分子標記，并將此方法命名為RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA).RAPD標記不要求特別純的DNA模板，而且RAPD方法具有簡單、迅速、可重復(fù)性好的特點[8].RAPD技術(shù)在國內(nèi)外已廣泛應(yīng)用于動、植物及微生物遺傳多樣性的檢測、遺傳育種、基因診斷、居群遺傳學(xué)、生物系統(tǒng)學(xué)與進化、物種品系鑒定、物種起源進化研究、基因定位、品系鑒定和遺傳圖譜構(gòu)建等方面的研究[9-13].

本文旨在用分子標記中的RAPD技術(shù)，對從溫州瑞安、平陽和樂清溫郁金種植地選取的5個居群、每個居群10個個體進行RAPD-PCR分析，以揭示溫郁金居群間的親緣關(guān)系以及遺傳背景，對人們了解溫郁金居群的遺傳多樣性、各居群之間的親緣關(guān)系以及溫郁金遺傳資源的收集、保護和利用提供理論基礎(chǔ).

1 材料

本實驗的材料來源于瑞安的沙洲、豐和、梅嶼，平陽的梅源以及樂清的四都這5個種植地，記為5個居群，每個居群隨機選取15～25個個體，分別裝袋，用硅膠干燥，并隨機對每個個體進行編號(1,2,3,…)，置于-70℃超低溫冰箱中保存，備用.

2 方法

采用改進的CTAB法[14]提取溫郁金的DNA基因組.

2.1 RAPD-PCR擴增反應(yīng)

反應(yīng)體系：擴增反應(yīng)在25 μL反應(yīng)體系中進行，其中含40 ng左右的基因組DNA模板，1×PCR Buffer，2.5 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTP，0.4 μmol/L 引物，Tag DNA聚合酶1.5 U，加ddH2O至25 μL.

PCR反應(yīng)在Whatman Biometra的Tpersonal PCR儀上進行[15],反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變5min；94 ℃變性0.5 min；35℃退火1.0min，72 ℃延伸1.5 min；循環(huán)35次;繼續(xù)72 ℃延伸10min.反應(yīng)結(jié)束后在4 ℃保存.

2.2 數(shù)據(jù)處理

利用凝膠成像系統(tǒng)(UVP)對基因組DNA的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖譜進行記錄，通過DL 2000 DNA Marker標注各條帶(擴增產(chǎn)物)的分子量，并導(dǎo)出Excel表格.無條帶的記為0，有條帶的記為1，形成0/1矩陣圖并輸入計算機.根據(jù)所得的0/1矩陣圖，利用POPGENE32軟件計算多態(tài)位點百分率、Nei’ s基因多樣性指數(shù)、Shannon’ s多態(tài)性信息指數(shù)、基因分化系數(shù)(Gst)、基因多樣度(Ht)、居群內(nèi)基因多樣度(Hs)、Nei’ s(1978)遺傳一致度和遺傳距離(D)，并根據(jù)Nei的遺傳一致度和遺傳距離繪制出UPGMA種系發(fā)生圖.

3 結(jié)果與分析

3.1 引物篩選

基因組DNA模板的質(zhì)量對PCR擴增反應(yīng)的結(jié)果有很大的影響，為了得到較純的基因組DNA模板，要盡量防止基因組DNA在提取過程中被污染和降解.使用已優(yōu)化好的RAPD反應(yīng)體系，對40個引物進行PCR擴增反應(yīng)，篩選出如下6個引物序列：5′-CAGGCCCTTC-3，5′-TGCCGAGCTG-3，5′-AATCGGGCTG-3，5′-GGGTAACGCC-3，5′-AGGTGACCGT-，5′-GTTGCGATCC-3.

3.2 RAPD-PCR擴增

用所選出引物參照優(yōu)化反應(yīng)體系對50個個體基因組DNA模板進行PCR擴增反應(yīng).譜帶統(tǒng)計表明，不同引物擴增出的帶數(shù)不同；同一個引物，不同居群之間的擴增帶數(shù)也略有不同.這反映了各個居群及個體間的多態(tài)性.

圖1 10個DNA基因組RAPD-PCR擴增條帶圖

3.3 居群遺傳多樣性分析

廣義的遺傳多樣性是指地球上所有生物所攜帶的遺傳信息的總和.但一般所指的遺傳多樣性是指種內(nèi)的遺傳多樣性，即種內(nèi)個體之間或一個群體內(nèi)不同個體的遺傳變異總和[16].遺傳多樣性的產(chǎn)生是由于遺傳信息在外界或內(nèi)在的因素作用下，在復(fù)制過程中出現(xiàn)差錯(如DNA片段的倒位、易位、缺失或轉(zhuǎn)座等)，從而導(dǎo)致了不同程度的遺傳變異.自然界的生物以極低的頻率不斷發(fā)生點突變和多種由DNA更新機制(DNA turn over mechanism)引起的更為復(fù)雜的突變，這些突變在漂變和漫長的選擇中走向固定和消失，形成了物種間和物種內(nèi)豐富的遺傳多樣性[17].

用有效的6個引物對50個個體進行PCR擴增反應(yīng)，共得到1 551條條帶和56個有效位點，其中多態(tài)位點有54個，多態(tài)性達到96.43%.這5個居群之間的多態(tài)位點百分率存在一定的差距，平陽梅源最大,為66.07%，樂清四都最小,為30.36%，平均多態(tài)位點百分率為46.07%，其大小依次為平陽梅源>瑞安豐和>瑞安沙洲>瑞安梅嶼>樂清四都.具體參數(shù)見表1.

表1 5個溫郁金居群的遺傳多樣性

從遺傳角度看，遺傳多樣性的降低往往意味著居群的適應(yīng)能力降低和有害基因增加，導(dǎo)致物種退化[18].但從表1可知，5個居群總的多態(tài)位點百分率為96.43%，說明總體的遺傳多樣性處于很高的水平；總體的Shannon’s指數(shù)為0.546 9±0.164 8，總體的Nei’s基因多樣性為0.371 5±0.131 5，也表明溫郁金居群的遺傳多樣性水平很高.但居群間的遺傳多樣性水平處于中等，多態(tài)位點百分率平均值僅為46.07%，Nei’s基因多樣性平均值僅為0.181 1±0.207 2，Shannon’s指數(shù)平均值僅為0.265 0±0.295 9.居群規(guī)模不斷縮小，這必然會導(dǎo)致遺傳漂變，其直接后果就是遺傳變異的下降[19].

擴增的DNA片段出現(xiàn)頻率小于0.99的位點為多態(tài)位點，是檢測到的位點中能反映變異水平的最直接的指標[20].多態(tài)位點百分率是衡量物種遺傳變異水平高低的一個重要指標[21]，是度量遺傳多樣性的重要參數(shù).實驗結(jié)果表明，溫郁金維持了很高的遺傳多樣性水平.物種的遺傳多樣性水平可以為其現(xiàn)狀和保護價值的評估以及遷地保護提供非常重要的信息.

在已有的研究中，不同物種基因組DNA多態(tài)性的程度是不一樣的.與芹菜、茄子等相比，姜品種變異的復(fù)雜性和分化程度較明顯，DNA的多態(tài)性最高，平均每個引物擴增DNA帶也較多，表明在DNA分子水平上，姜品種存在比較豐富的遺傳變異，這正是姜具有極其豐富品種的分子基礎(chǔ)[22].

采用POPGEN32軟件進行分析，得到總基因多樣度Ht=0.371 5 ±0.017 3，居群內(nèi)基因多樣度Hs=0.181 1±0.009 3.根據(jù)遺傳多樣性水平在居群內(nèi)(Hs)和居群間(Ht-Hs)的分化，兩個居群之間的Nei’s基因分化系數(shù)為：

這應(yīng)該與其為人工栽培有很大的關(guān)系.據(jù)筆者調(diào)查了解，各居群的種植戶多是自己留種，而且各種植地之間存在一定的距離.居群間的遺傳分化是當?shù)刈匀贿x擇的結(jié)果，由不連續(xù)的生境異質(zhì)性引起的居群分化被認為是自然選擇的一種[23]，居群間的遺傳分化是由遺傳漂變引起的.

3.4 居群間遺傳關(guān)系的分析

利用POPGENE32軟件計算溫郁金居群間的Nei’s無偏差遺傳距離和遺傳一致度，結(jié)果見表2.由表2可知，5個溫郁金居群間的Nei’s無偏差遺傳距離在0.134 4～0.473 9之間；其中樂清四都和平陽梅源兩居群之間遺傳距離最小(0.134 4)，兩者之間的遺傳一致度最大(0.874 3)；瑞安沙洲和樂清四都之間的遺傳距離最大(0.473 9)，兩者之間的遺傳一致度最小(0.622 6).

表2 溫郁金居群間的Nei’s無偏差遺傳距離(對角線以下)及遺傳相似系數(shù)(對角線以上)

使用軟件POPGENE32對0/1矩陣圖進行分析，根據(jù)Nei的遺傳一致度和遺傳距離最后形成一個樹型的UPGMA聚類圖,見圖2.圖2清楚地反映了各居群間的關(guān)系：5個居群分為兩大支，樂清四都和平陽梅源兩個居群之間的遺傳距離最小，首先聚為一類；瑞安梅嶼和瑞安豐和兩居群之間的遺傳距離次之，聚為二類；然后這兩類又聚在一起.最后和瑞安沙洲再聚在一起.

分析樂清四都和平陽梅源聚在一起的原因可能是這兩個居群的種子來源于一地，據(jù)瑞安種植地農(nóng)民介紹，樂清四都和平陽梅源的溫郁金的種植都是從他們這里引種的，種植的時間也僅僅幾年的時間，受其環(huán)境的影響不大，而且居群間的基因交流非常狹小.而瑞安沙洲居群與其他居群之間的遺傳距離最遠，筆者在溫郁金還未到成熟時去采樣發(fā)現(xiàn)，瑞安沙洲的溫郁金已經(jīng)枯萎，與次日觀察到的瑞安梅嶼和瑞安豐和的溫郁金相差很大.據(jù)種植戶介紹，其原因可能是生長環(huán)境受到周邊很多磚廠的污染，使得種質(zhì)發(fā)生了退化，基因組DNA發(fā)生一些變異，導(dǎo)致與其它居群遺傳距離最遠.

遺傳多樣性是生物多樣性研究的核心，反映了物種的遺傳背景、育種潛力和利用價值，對優(yōu)良種質(zhì)的保護和發(fā)掘利用具有重要意義.本文對溫郁金居群的遺傳多樣性進行研究，了解各居群之間的親緣關(guān)系，但由于采用的標記方法、樣本數(shù)等不同，得到的結(jié)果與他人[24-25]有所不同，還需進一步深入探討.建立溫州溫郁金品種的標準指紋圖譜,整理其種質(zhì)資源，為溫郁金的栽培育種工作及資源的合理利用是十分有意義的.

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