舟山群島四個養(yǎng)殖獐種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)

林杰君，鮑毅新，劉 軍，王艷妮，張 旭

(浙江師范大學(xué)生態(tài)研究所，金華 321004)

獐(Hydropotes inermis)，別名牙獐、河麂，屬于偶蹄目(Artiodactyla)鹿科(Cervidae)獐屬(Hydropotes)，是國家Ⅱ級重點(diǎn)保護(hù)動物，目前在我國較集中的分布區(qū)是浙江舟山群島、江蘇沿海地區(qū)、江西鄱陽湖地區(qū)、湖南、湖北的洞庭湖和廣大水網(wǎng)地區(qū)［1］，而以舟山群島上的分布數(shù)量最多［2-3］。由于經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使，使得獐的偷獵現(xiàn)象非常嚴(yán)重，根據(jù)2009年對舟山市鹿科動物資源的調(diào)查，舟山群島野生獐的資源總量約為2100—2600只，比1997年已銳減一半。人為養(yǎng)殖種群被認(rèn)為是一種保護(hù)瀕危物種的重要手段［4］，能有效減少偷獵行為的發(fā)生。近年來，隨著對獐的日益了解和養(yǎng)殖技術(shù)的不斷發(fā)展，養(yǎng)殖獐已成為熱點(diǎn)并得到了迅速發(fā)展，其種源主要來自舟山群島［5］。目前，在舟山群島養(yǎng)殖獐種群數(shù)量約1000余只，主要集中在舟山本島、秀山島、岱山島和朱家尖島，其它島嶼基本上沒有獐養(yǎng)殖場。為了保持獐資源的可持續(xù)利用，有必要對養(yǎng)殖獐種群的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

迄今為止，獐的研究主要集中在行為觀察［6-7］、生境選擇［8-9］及致危原因［10-11］等方面。在分子生物學(xué)方面的研究，Hu等［12-13］曾應(yīng)用微衛(wèi)星標(biāo)記和線粒體控制區(qū)對大陸種源和舟山種源的獐種群進(jìn)行分析，兩者的結(jié)果都發(fā)現(xiàn)舟山種源的獐種群遺傳多樣性水平要低于大陸種群。舟山群島是在第三紀(jì)末浙東地層下降時，與大陸分離而形成的，屬于里亞斯型海島區(qū)地貌，各島嶼間被海水隔離，在一定程度上阻礙了獐在不同島嶼間的遷移，這可能是造成舟山種群遺傳多樣性偏低的主要原因。

簡單重復(fù)序列間區(qū)(ISSR)標(biāo)記技術(shù)是在微衛(wèi)星標(biāo)記的基礎(chǔ)上直接建立起來的一種分子標(biāo)記技術(shù)［14］，具有簡單、經(jīng)濟(jì)、快速、有效等優(yōu)點(diǎn)。近年來，也越來越多地被應(yīng)用到動物研究中來，并在動物遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)方面取得了不錯的研究成果［15-17］。本研究利用ISSR分子標(biāo)記對舟山不同島嶼上養(yǎng)殖場內(nèi)獐種群的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并深入探討了各養(yǎng)殖場獐種群的遺傳特點(diǎn)，以期為舟山群島獐保護(hù)策略的制定和實施提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料采集

在獐養(yǎng)殖場比較集中的舟山本島、秀山島、岱山島和朱家尖島，選擇規(guī)模較大、養(yǎng)殖規(guī)范、有代表性的4個獐養(yǎng)殖場進(jìn)行采樣，各種群采樣地見圖1，各采樣養(yǎng)殖場所在島嶼的生態(tài)特征和采樣數(shù)量見表1，根據(jù)個體來源的記錄，實驗所用樣本是捕獲于各養(yǎng)殖場所在的島嶼或由這些個體相互交配所產(chǎn)的后代，以自然死亡個體和由于年老等原因而淘汰個體的少量肌肉組織作為實驗樣本，由各養(yǎng)殖場提供，在選擇樣本過程中，一般是根據(jù)養(yǎng)殖場的個體來源記錄，選擇無血緣關(guān)系或親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的個體，避免個體間存在直系血緣關(guān)系，帶回實驗室置于-70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 4個獐種群取樣地點(diǎn)Fig.1 Location of the four cultured populations of Hydropotes inermis in Zhoushan Archipelago

表1 四個取樣島嶼的生態(tài)特征及樣本量Table 1 Ecological characteristics of the four islands and number of samples

1.2 DNA提取

參照鮑毅新等［18］改進(jìn)的方法對肌肉組織進(jìn)行基因組DNA的提取。

1.3 引物選擇及PCR擴(kuò)增

本實驗共使用26條ISSR引物，包括已發(fā)表的可應(yīng)用于獐物種的10條(UBC 808、809、811、816、818、827、830、841、844、848)［19］，另外，篩選出多態(tài)性高、標(biāo)記位點(diǎn)豐富、重復(fù)性好的適合獐基因擴(kuò)增的ISSR引物16條(UBC 807、810、812、815、822、823、826、834、836、840、842、855、857、858、860、873)，各引物的序列和最佳最火溫度見表2。

ISSR-PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序采用張龍龍等［19］所確立的獐ISSR-PCR反應(yīng)最優(yōu)體系及擴(kuò)增程序，其中對最佳循環(huán)次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)35次循環(huán)時，效果最好，其余步驟均相同。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離(120 V，90 min)，使用BIO-RAD紫外凝膠成像系統(tǒng)(購自BIO-RAD公司)拍照、觀察。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用軟件Gel-Pro 4.5統(tǒng)計條帶的數(shù)目及長度，然后檢測不同種群個體條帶的有無，清晰可見的條帶全部用于統(tǒng)計分析。按條帶的有無進(jìn)行計數(shù)，在指定遷移位置出現(xiàn)的條帶，被認(rèn)為是具有相同的DNA片段產(chǎn)物，計數(shù)為“1”，不存在則為“0”，構(gòu)建“01”二元矩陣數(shù)據(jù)，以此把圖像數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為二元數(shù)據(jù)。

采用POPGENE 1.32軟件［20］計算4個種群的觀察等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei′s遺傳多樣性指數(shù)(H)、Shannon′s多態(tài)信息指數(shù)(I)和多態(tài)位點(diǎn)百分比(PPL)等遺傳多樣性指標(biāo)，并計算物種水平上的各遺傳多樣性指標(biāo)，以及各種群間的遺傳分化系數(shù)(Gst)、Nei′s遺傳距離(GD)和遺傳相似度(GI)。

利用Arlequin 3.11軟件［21］對各種群進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)的分子變異分析(AMOVA)。

利用Structure 2.2軟件［22，23］對4個獐種群進(jìn)行貝葉斯聚類分析，對參數(shù)MCMC開始時的不作數(shù)迭代和不作數(shù)迭代后的MCMC(number of MCMC reps after burn-in)都設(shè)置為10000次，K值為1—6，每個K值各自獨(dú)立運(yùn)行5次，計算每個K值下的對數(shù)似然函數(shù)值(lnP(D)，log likelihood function value)，并取平均值即為每個K的lnP(D)，再利用公式:，計算出每個K值相對應(yīng)的△K值，其中L( K)=lnP( D)［24］。根據(jù)K與△K的關(guān)系，確定最佳K值，即為從遺傳結(jié)構(gòu)上認(rèn)定的最佳組群數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 26條ISSR引物擴(kuò)增結(jié)果

從表2中可以看出，26條ISSR引物共擴(kuò)增出286個位點(diǎn)，平均每條引物擴(kuò)增出11條DNA片段，引物UBC 810擴(kuò)增出的位點(diǎn)數(shù)是最多的，共有17個位點(diǎn)，而引物UBC 816擴(kuò)增出的位點(diǎn)數(shù)是最少的，只有7個位點(diǎn)，其余引物擴(kuò)增出的位點(diǎn)數(shù)介于兩者之間。共擴(kuò)增出184個多態(tài)性位點(diǎn)，即平均每條引物擴(kuò)增出7個多態(tài)性位點(diǎn)，總的多態(tài)性比率為64.34%。其中，引物UBC 812揭示的變異是最高的，多態(tài)性比率高達(dá)90.91%，而引物UBC 860的多態(tài)性比率只有37.50%，其所反映的變異是最低的，其余ISSR引物的多態(tài)性比率介于兩者之間，圖2和圖3為部分引物在一些獐個體中的擴(kuò)增電泳圖，結(jié)果顯示，擴(kuò)增效果較為清晰。以上結(jié)果表明本次實驗所選用的這26條ISSR引物可用于獐遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的分析。

圖2 ISSR引物UBC 822在部分個體中的擴(kuò)增電泳圖Fig.2 The amplification of primer UBC 822 in several individuals of Hydropotes inermis

2.2 獐種群的遺傳多樣性差異

從表3的觀察等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、多態(tài)位點(diǎn)百分比(PPL)、Nei′s遺傳多樣性指數(shù)(H)和Shannon′s多態(tài)信息指數(shù)(I)這些遺傳多樣性參數(shù)來看，不同獐種群的遺傳多樣性存在一定差異，各項遺傳參數(shù)均以舟山本島獐種群(ZS)最高(Na=1.486，Ne=1.333，H=0.190，I=0.278，PPL=48.60%)，其次為岱山種群(DS)、秀山種群(XS)、朱家尖種群(ZJJ)，且其物種水平上的遺傳多樣性要高于種群水平，種群水平表示的是各種群間的平均水平，而物種水平是將所有個體當(dāng)作一個大種群來研究，顯示的是舟山群島獐的整體水平，所以其值較高。

表2 26條引物名稱、序列、最佳退火溫度及其在四個種群中的擴(kuò)增條帶數(shù)與多態(tài)性比率Table 2 Names，sequences，annealing temperatures and polymorphic ratios of the loci amplified by 26 ISSR primers

圖3 ISSR引物UBC 841在部分個體中的擴(kuò)增電泳圖Fig.3 The amplification of primer UBC 841 in several individuals of Hydropotes inermis

表3 舟山4個獐種群遺傳多樣性差異Table 3 Genetic diversity of four Hydropotes inermis populations in Zhoushan Archipelago

2.3 獐種群遺傳結(jié)構(gòu)分析

通過計算△K發(fā)現(xiàn)，當(dāng)K=4時，△K取得最大值，由此認(rèn)為，所有個體根據(jù)遺傳結(jié)構(gòu)組成不同可分為4個組群。當(dāng)K=4時，從圖4中可以看出，在岱山種群(pop1)中，白色占了大部分;在秀山種群(pop2)中，深灰色占了大部分;在朱家尖種群(pop3)中，黑色占了大部分;在舟山本島種群(pop4)中，淺灰色占了大部分，也就是說，根據(jù)遺傳信息的不同，各種群中的大部分個體大多集中在根據(jù)地理信息來劃分的類群中，說明各種群間已存在一定程度的遺傳差異。

圖4 用種群來源信息進(jìn)行STRUCTURE分析得到的分配圖(K=4)Fig.4 Inferred clusters based on STRUCTURE analysis using prior information of population origin(K=4)

2.4 獐種群的遺傳分化

遺傳分化系數(shù)Gst被認(rèn)為是反映種群遺傳分化的重要指標(biāo)，本研究中Gst為0.163，認(rèn)為有16.30%的遺傳分化發(fā)生在種群間，而有83.70%的遺傳分化發(fā)生在種群內(nèi)。當(dāng)Gst在0—0.05之間，表明種群間遺傳分化程度很弱，0.05—0.15之間表明已有中等程度的分化，0.15—0.25之間表明具有較大的分化，大于0.25表明分化極大［25］，說明實驗中各種群間已存在較大的遺傳分化，AMOVA分析結(jié)果也表明，種群間遺傳變異占總變異的11.96%，種群內(nèi)占88.04%(表4)，兩者結(jié)果類似。

表4 獐種群間和種群內(nèi)分子變異的AMOVA分析Table 4 Analysis of molecular variance(AMOVA)within and among Hydropotes inermis populations

2.5 獐種群間遺傳關(guān)系

岱山種群和朱家尖種群間遺傳距離是最大的，為0.066，而秀山種群和舟山本島種群的遺傳距離為0.045，是所有遺傳距離中最近的，其余種群間的遺傳距離介于兩者之間。遺傳相似度與遺傳距離表現(xiàn)為相同的趨勢，舟山本島種群和秀山種群的遺傳相似度是最高的(GI=0.956)，而岱山種群和朱家尖種群的遺傳相似度是最低的，為0.936(表5)。

表5 獐種群間Nei's遺傳距離與遺傳相似度Table 5 Genetic identity and genetic distance among Hydropotes inermis populations

3 討論

3.1 遺傳多樣性

遺傳多樣性在廣義上是指生物所攜帶遺傳信息的總和，在狹義上則是指種內(nèi)不同種群和個體間的遺傳多態(tài)性程度［26］，是種群繁殖和更新的遺傳基礎(chǔ)，可反映一個物種適應(yīng)環(huán)境的能力和對環(huán)境變遷持續(xù)進(jìn)化的潛力［27］，是生物多樣性的一個重要方面，因此對遺傳多樣性的研究具有重要意義。在基于ISSR標(biāo)記的分析中，遺傳多樣性的高低常以Nei′s遺傳多樣性指數(shù)(H)和Shannon′s多態(tài)信息指數(shù)(I)這兩個指標(biāo)來度量［28］。在利用ISSR標(biāo)記對哺乳動物的研究中，在物種水平上，高原鼠兔(Ochotona curzoniae)的H為0.2306，I為0.3531［28］，伊朗哈馬丹省常見的一種綿羊的 H 為 0.1258，I為 0.2256［29］;在種群水平上，Askari等［30］曾利用ISSR標(biāo)記對伊朗科爾曼地區(qū)4種16個經(jīng)濟(jì)價值較高的家畜種群進(jìn)行了遺傳多樣性研究，發(fā)現(xiàn)山羊的H為0.0655—0.1052，I為0.1034—0.1604，綿羊的 H 為 0.1052—0.2076，I為 0.2938—0.3058，荷士登乳牛品種的H為0.0891—0.1240，I為0.1449—0.2204，伊朗本地牛的H為0.0950—0.1517，I為0.1481—0.2328。而在本研究中，獐物種水平上的H為0.210，I為0.318;在種群水平上的H為0.157—0.190，I為0.228—0.278，與這些已報道的結(jié)果相比較而言，具有相對較高的遺傳多樣性，之前，Hu等［12，13］曾利用線粒體和微衛(wèi)星標(biāo)記對野生的舟山獐種群進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，與其它稀有鹿類動物相比，其遺傳多樣性處于較高的水平。據(jù)報道，獐在我國養(yǎng)殖的時間并不是很長，僅有30余年的歷史，最早實現(xiàn)人工飼養(yǎng)的單位是南京動物園，直到20世紀(jì)90年代中期，也僅有少數(shù)的幾家動物園或大學(xué)(如南京動物園，華東師范大學(xué))飼養(yǎng)有少量的獐，主要用于觀賞或科研，直到1997年以后，隨著人們對獐的經(jīng)濟(jì)價值有了認(rèn)識，以及養(yǎng)殖技術(shù)的成熟，養(yǎng)殖獐才得以迅速地發(fā)展起來［5］。而舟山地區(qū)最早實現(xiàn)獐養(yǎng)殖距今也才20多年的時間，并且，該地區(qū)養(yǎng)殖場內(nèi)的種源大多來自野外，這些可能是舟山養(yǎng)殖獐種群具有相對較高遺傳多樣性水平的原因。

就各種群而言，舟山本島種群的遺傳多樣性表現(xiàn)出最高的水平，這可能與舟山本島的面積最大有關(guān)，而在小島上則更容易發(fā)生近交，遺傳漂變可導(dǎo)致種群遺傳多樣性的降低［31-32］，而朱家尖島是舟山的第五大島，其面積大于秀山島，但種群的遺傳多樣性卻是最低的，這可能是由于受養(yǎng)殖場規(guī)模和實際情況的限制而使得朱家尖島取的樣本量偏少有關(guān)，也有可能跟下面提到的與其它島嶼上獐的交流較少有關(guān)，對于朱家尖島種群遺傳多樣性偏低的影響因素還有待進(jìn)一步研究。

3.2 遺傳結(jié)構(gòu)

遺傳結(jié)構(gòu)是指遺傳變異的分布式樣或格局，是生物的基因和基因型在時間和空間上的分布形式［33-34］，其受突變、基因流、自然選擇和遺傳漂變的共同作用，同時還與物種的進(jìn)化歷史和生物學(xué)特征有關(guān)［35］，是遺傳學(xué)研究的一個重要內(nèi)容。Structure軟件在揭示種群遺傳結(jié)構(gòu)方面具有較強(qiáng)的直觀性，能反映出種群內(nèi)或亞群間一定的個體關(guān)系，結(jié)合一定的種群地理及歷史事件信息，還能揭示一定的種源問題［36］。利用該軟件對59頭獐組成的群體的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，按每頭獐的來源進(jìn)行聚類(圖4)，結(jié)果則顯示，不同地理養(yǎng)殖場的大部分個體已集中在各自獨(dú)立的組群中，這暗示各種群間可能已存在一定的分化現(xiàn)象，雖然在這4個種群間表現(xiàn)出有一定的基因混合(圖4中每個種群內(nèi)混合有4種不同的顏色)，但POPGENE軟件對這4個種群遺傳分化系數(shù)的計算結(jié)果(Gst=0.163)與各種分化跡象保持了一致性。舟山群島的島嶼生境是生境片段化的一種獨(dú)特形式，而片段化生境會影響物種種群間基因交流［37］及物種間相互作用［38-39］。Dixo等［40］發(fā)現(xiàn)，巴西熱帶雨林的片段化對生活其中的蟾蜍(Rhinella ornata)間的基因交流造成了影響，Manel等［41］也指出島嶼地理隔離可阻礙基因交流。雖然，獐被認(rèn)為具有游泳的能力，可達(dá)數(shù)公里的水域距離［42］，但是這并不代表這種游泳現(xiàn)象時常發(fā)生。郭光普和張恩迪［1］曾指出獐的游泳行為并不是主動的，而是迫于諸如種群壓力、資源、偷獵者或家犬的追捕等因素不得已而為之的，這可能也是各種群間存在分化的原因，但也有可能是各個養(yǎng)殖場由于相互隔離的原因造成了分化的現(xiàn)象，總之，不論這些種群之前交流程度如何，從結(jié)果上看，現(xiàn)在它們之間已經(jīng)出現(xiàn)了較高的遺傳分化，并且在今后的種群發(fā)展中這些分化可能會更大。

另外我們還計算了各種群間的Nei′s遺傳距離，從結(jié)果來看，舟山本島種群(ZS)、秀山種群(XS)和岱山種群(DS)相互間的遺傳距離較近，而朱家尖種群(ZJJ)與其它種群間的遺傳距離較遠(yuǎn)。對于朱家尖種群(ZJJ)的遺傳結(jié)構(gòu)出現(xiàn)較大差異的原因有可能是:舟山群島的獐是從舟山本島向整個群島擴(kuò)散的［1］，即朱家尖的獐最初可能來自于舟山本島，但隨著舟山本島東部普陀區(qū)的開發(fā)，剛好與朱家尖島相對，繁華的都市阻礙了獐在兩島之間的遷移，即在養(yǎng)殖場建立之前，朱家尖種群與這些種群的基因交流較少，另外，郭光普和張恩迪［1］在對舟山群島獐的分布進(jìn)行調(diào)查時，發(fā)現(xiàn)岱山島附近的官山島和小長涂島均有獐的分布，而朱家尖島東側(cè)2.2 km的白沙島卻無獐的分布，這也在一定程度上阻礙了朱家尖島獐種群與外界的交流。亦或是各種群養(yǎng)殖前的遺傳情況相差不多，由于養(yǎng)殖后近交程度不同而導(dǎo)致了各養(yǎng)殖場現(xiàn)如今的遺傳格局。結(jié)合實際地理分布和各種群間遺傳距離的情況，可認(rèn)為前者的原因更大。

3.3 獐保護(hù)建議

從此次實驗結(jié)果上看，各養(yǎng)殖場內(nèi)的獐種群已出現(xiàn)了較大的遺傳分化，由于在養(yǎng)殖條件下更容易發(fā)生近交，在今后的養(yǎng)殖過程中，其分化程度可能會更大，甚至?xí)a(chǎn)生奠基者效應(yīng)而使基因歧異度趨向相同，不能夠適應(yīng)多變的環(huán)境，而使得這些養(yǎng)殖種群受到更大的淘汰威脅，并給養(yǎng)殖戶帶來巨大的損失，因此，在條件允許的情況下，可以適當(dāng)補(bǔ)充野外個體，但獐作為國家Ⅱ級重點(diǎn)保護(hù)動物，對其野生資源的利用應(yīng)該盡量減少，我們建議可以在不同養(yǎng)殖場之間進(jìn)行個體的交流，特別是加強(qiáng)朱家尖島獐種群與其它種群間的交流，這樣也能進(jìn)一步改善養(yǎng)殖種群的遺傳狀況，但這同時也加重了養(yǎng)殖戶的管理難度，可以結(jié)合電子標(biāo)簽技術(shù)對獐個體進(jìn)行身份編號，并認(rèn)真記錄個體間的交流情況，這不僅是對獐養(yǎng)殖進(jìn)行科學(xué)管理的有效方式，也是提高養(yǎng)殖品質(zhì)的基礎(chǔ)。另外，舟山群島作為獐的主要分布區(qū)，在合理利用獐的同時，對其野生資源的就地保護(hù)也是非常重要的，當(dāng)前，偷獵行為還比較嚴(yán)重，有關(guān)部門在加強(qiáng)宣傳教育工作的同時，也要嚴(yán)厲打擊破壞野生獐資源的違法行為，并加強(qiáng)棲息地的生態(tài)保護(hù)，從可持續(xù)的角度對獐進(jìn)行保護(hù)和合理利用。

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