低溫脅迫后抗寒茶樹品種‘紫陽圓葉’的基因差異表達(dá)分析

程國山，游新才，武 艷，張今今，①

(1.陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062;2.陜西省紫陽縣茶葉研究所，陜西紫陽725300)

茶樹〔Camellia sinensis(Linn.)O.Ktze.〕隸屬于山茶科(Theaceae)山茶屬(Camellia Linn.)，為多年生喜溫葉用經(jīng)濟(jì)植物，原產(chǎn)于中國云南，自然分布于中國西南和華南，在東南亞北部也有分布。隨著人類的引種栽培活動范圍擴(kuò)大，茶樹的種植區(qū)域也由南向北逐漸遷移。近年來由于全球氣溫變化不穩(wěn)定，“倒春寒”和“霜凍”等低溫寒害在中國茶區(qū)頻繁發(fā)生，嚴(yán)重影響茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)，低溫已經(jīng)成為制約茶葉產(chǎn)業(yè)發(fā)展的最主要的氣象災(zāi)害［1］。因此，研究茶樹的抗寒機(jī)制、篩選優(yōu)良的茶樹抗寒基因、提高茶樹抵御低溫災(zāi)害的能力，已經(jīng)成為茶葉科學(xué)領(lǐng)域重要的研究課題之一。

陜西省秦巴山區(qū)種茶產(chǎn)茶歷史悠久，茶樹資源分布廣泛，遺傳多樣性豐富［2］。陜南茶區(qū)作為中國茶樹適宜生長區(qū)的最北緣，較南方茶區(qū)緯度高且年平均氣溫低。在經(jīng)歷漫長的繁衍和進(jìn)化過程后，長期處于低溫環(huán)境中的秦巴山區(qū)地方茶樹種質(zhì)有可能產(chǎn)生對低溫脅迫耐受的形態(tài)和生理生化特征，具備一定的抗寒性。鑒于此，在前期對23個陜西地方茶樹品種以及6個外地引進(jìn)茶樹品種的抗寒性進(jìn)行綜合評價(jià)的基礎(chǔ)上，作者所在的研究小組篩選出了包括‘紫陽圓葉’(‘Ziyangyuanye’)在內(nèi)的陜西省特有的優(yōu)良抗寒茶樹品種［3］。

早期茶樹抗寒性研究多集中在茶樹葉片解剖結(jié)構(gòu)與抗寒性關(guān)系以及低溫脅迫下葉片細(xì)胞原生質(zhì)膜透性、水分含量、抗氧化酶類活性和光合作用或呼吸作用強(qiáng)度等生理生化指標(biāo)的變化方面［4-6］。隨著分子生物學(xué)理論和技術(shù)的不斷發(fā)展，有關(guān)茶樹低溫脅迫和抗寒性分子機(jī)制的研究取得了顯著進(jìn)展。目前，通過對低溫和常溫下基因表達(dá)差異進(jìn)行比較以分離茶樹在低溫脅迫下差異表達(dá)的基因是茶樹抗寒性分子機(jī)制研究的主要方法［7-8］。在用于克隆差異表達(dá)基因的方法中，DDRT-PCR技術(shù)所需的RNA量少、重復(fù)性好，是分析植物基因差異表達(dá)的有利工具，已被廣泛應(yīng)用于植物抗逆性研究［9］。

近年來，以陜西地方茶樹種質(zhì)為材料的抗寒性研究也有報(bào)道，但僅局限于葉片解剖結(jié)構(gòu)和低溫脅迫下茶樹葉片生理生化指標(biāo)的變化等方面［3，10］，而對低溫脅迫誘導(dǎo)下茶樹特異基因的表達(dá)和茶樹抗寒性分子機(jī)制的研究尚未見報(bào)道。為了更全面地發(fā)掘和了解陜西特有的茶樹抗寒種質(zhì)中的相關(guān)基因及其功能，作者利用DDRT-PCR技術(shù)，分析了經(jīng)低溫脅迫不同時間后抗寒茶樹品種‘紫陽圓葉’基因差異表達(dá)的結(jié)果，并通過半定量RT-PCR驗(yàn)證差異表達(dá)基因的表達(dá)特性，以期揭示茶樹抗寒性的分子機(jī)制，為通過基因工程技術(shù)提高中國北方茶區(qū)茶樹的抗寒性奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為優(yōu)良抗寒茶樹品種‘紫陽圓葉’(‘Ziyangyuanye’)，取自陜西省安康市紫陽縣茶葉試驗(yàn)站。錨定引物和隨機(jī)引物為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品;DNaseⅠ (RNase-free)、MMLV反轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶、dNTPs和DL2000 Marker等購自寶生物工程(大連)有限公司。所用儀器為PTC-200 PCR儀和Sequi-Gen GT測序電泳儀(Bio-Rad)、Microfuge 22R離心機(jī)(Beckman Coulter)、Tanon-1600全自動凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)、NanoDrop 2000超微量紫外分光光度計(jì)(Thermo Scientific)。

1.2 方法

1.2.1 低溫處理方法 挖取長勢良好、無病蟲害、株高約30 cm的2年生扦插苗，移栽至陜西師范大學(xué)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室的人工氣候箱(溫度25℃、空氣相對濕度65%)中培養(yǎng)，并按統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行水肥管理。待茶樹苗生長穩(wěn)定后置于人工氣候箱中于4℃進(jìn)行低溫處理，處理時間分別為0、8、12、24和48 h，每一處理組4株扦插苗，3次重復(fù)。低溫處理結(jié)束后在扦插苗對應(yīng)位置上取當(dāng)年生新梢第2和第3枚真葉，迅速置于液氮中冷凍后，于-80℃冰箱中保存、備用。

1.2.2 總RNA提取和cDNA第1鏈合成 取凍存葉片約 500 mg，采用改良的 SDS-酸酚法［11］提取總RNA;用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性，并用超微量紫外分光光度計(jì)測定其純度和濃度。反轉(zhuǎn)錄引物分別為 B0327、B0328和B0329(序列見表1)，以總RNA為模板，參照Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H)使用說明書合成cDNA第1鏈。

1.2.3 DDRT-PCR分析 以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第1鏈為模板，用 3條錨定引物(B0327、B0328和B0329)與7條隨機(jī)引物(B0305～B0311)(序列見表1)組成21個引物對組合，分別進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，重復(fù)2次。擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性1 min;94℃變性30 s，45℃退火2 min，72℃延伸30 s，共40個循環(huán);最后于72℃延伸10 min。取擴(kuò)增產(chǎn)物4 μL，加入3 μL上樣緩沖液于95℃變性5 min，冰浴3 min后用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色，拍照記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

表1 用于茶樹品種‘紫陽圓葉’基因DDRT－PCR的引物序列Table 1 Primer sequences used for DDRT-PCR of Camellia sinensis‘Ziyangyuanye’gene

1.2.4 cDNA差異片段的回收、測序及分析 挑選差異片段，采用煮沸法回收并二次擴(kuò)增，所用的引物對組合及擴(kuò)增條件與上述DDRT-PCR分析相同;擴(kuò)增產(chǎn)物用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1.4%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，篩選僅有1條擴(kuò)增產(chǎn)物且與DDRT-PCR擴(kuò)增結(jié)果長度一致的片段，交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。測序結(jié)果經(jīng)GenBank和EST等數(shù)據(jù)庫BLASTn和BLASTx檢索，分析同源性。

1.2.5 半定量 RT-PCR分析與驗(yàn)證 參照 Prime ScriptRT reagent Kit說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈。根據(jù)BLAST檢索結(jié)果并采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，選擇功能明確的差異片段進(jìn)行半定量RT-PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1.4%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果和分析

2.1 總RNA提取及檢測結(jié)果

經(jīng)質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，從經(jīng)過4℃低溫處理不同時間的茶樹2年生扦插苗葉片中提取的總RNA的28S、18S和5S帶型清晰、銳度好且無彌散(圖1)。說明其總RNA較完整且無降解。用超微量紫外分光光度計(jì)測定吸光度(A)，結(jié)果顯示:A260/A280為1.9 ～2.0，A260/A230大于 2.0，表明獲得的RNA純度較高，可以用作反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的模板。

圖1 低溫(4℃)脅迫不同時間后茶樹品種‘紫陽圓葉’葉片總RNA的電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis result of total RNA of Camellia sinensis‘Ziyangyuanye’leaf after treated by low temperature(4℃)stress for different times

2.2 mRNA差異顯示結(jié)果

在4℃低溫條件下對茶樹品種‘紫陽圓葉’2年生扦插苗分別處理0、8、12、24和48 h，對5個處理組扦插苗葉片的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行DDRT-PCR擴(kuò)增，其中部分引物對的擴(kuò)增結(jié)果見圖2。擴(kuò)增結(jié)果顯示:共有12個引物對擴(kuò)增出有明顯差異的cDNA片段。這些差異片段在低溫脅迫條件下表現(xiàn)為2種類型:第1類為抑制表達(dá)片段，即隨脅迫時間延長cDNA片段的強(qiáng)度呈減弱趨勢，如差異片段DF-8(圖2-A)和DF-2(圖2-B);第2類為誘導(dǎo)表達(dá)片段，在處理的開始階段(0 h)即表達(dá)但強(qiáng)度較弱，隨低溫處理時間延長這些片段的強(qiáng)度遞增，至處理24 h后達(dá)到最強(qiáng)，如差異片段DF-3(圖2-C)。

圖2 經(jīng)低溫(4℃)脅迫不同時間后茶樹品種‘紫陽圓葉’的部分DDRT－PCR擴(kuò)增圖譜Fig.2 A part of amplification pattern of DDRT-PCR of Camellia sinensis‘Ziyangyuanye’after treated by low temperature(4℃)stress for different times

2.3 差異片段的二次PCR擴(kuò)增結(jié)果

通過上述DDRT-PCR擴(kuò)增獲得差異片段，對差異片段回收后進(jìn)行二次PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果顯示(圖3):差異片段DF-8、DF-2和DF-3的二次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均為1條片段，且分子量與變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中一致。說明3條差異片段均為陽性。

圖3 經(jīng)低溫(4℃)脅迫不同時間后茶樹品種‘紫陽圓葉’差異片段的二次PCR擴(kuò)增圖譜Fig.3 Amplification pattern of the second PCR of differential fragments of Camellia sinensis‘Ziyangyuanye’after treated by low temperature(4℃)stress for different times

2.4 差異片段測序結(jié)果及同源性比對

差異片段DF-8、DF-2和DF-3經(jīng)測序并通過BLASTn進(jìn)行同源性比對，結(jié)果表明:差異片段DF-8長度為217 bp，與多個茶樹品種的谷氨酰胺合成酶基因片段有很高的同源性，與‘安吉白茶’(Camellia sinensis‘Anjibaicha’)和‘龍井 43’(C.sinensis‘Longjing 43’)的谷氨酰胺合成酶基因的同源性分別為96%和91%;與茶樹谷氨酰胺合成酶基因、‘安吉白茶’谷氨酰胺合成酶基因、茶樹細(xì)胞質(zhì)谷氨酰胺合成酶基因和‘龍井43’細(xì)胞質(zhì)谷氨酰胺合成酶基因的同源性序列mRNA的期望值分別為1e-76、7e-75、3e-28和2e-26;故以“茶樹谷氨酰胺合成酶基因片段(Csgsf，Camellia sinensis glutamine synthetase fragment)”命名。相關(guān)序列同源性的BLASTx比對結(jié)果顯示:Csgsf與多種植物谷氨酰胺合成酶基因高度同源，與菜豆(Phaseolus vulgaris Linn.)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula Gaertn.)、油棕(Elaeis guineensis Jacq.)、西 洋 參 (Panax quinquefolius Linn.)和 水 稻(Oryza sativa Linn.)谷氨酰胺合成酶基因的同源性分別達(dá)到100%、97%、97%、97%和93%，因此推測該片段即為‘紫陽圓葉’谷氨酰胺合成酶基因片段。

差異片段DF-2和DF-3的堿基數(shù)分別為316和232 bp，均為低溫脅迫下差異表達(dá)的片段，故命名為“茶樹冷誘導(dǎo)基因片段(Cscaf，Camellia sinensis cold acclimation fragment)”，分別用Cscaf1和Cscaf2表示。EST數(shù)據(jù)庫的檢索結(jié)果顯示:Cscaf2與茶樹干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的cDNA的同源性為100%，與茶樹干旱抑制消減雜交文庫保守假定蛋白相似cDNA(CsSSHFD946)和茶樹干旱抑制消減雜交文庫未命名蛋白相似cDNA(CsSSHFD600)的期望值分別為1e-106和1e-101;而Cscaf1未能檢出同源序列，推測其為與冷脅迫相關(guān)的未知基因。

2.5 半定量RT－PCR結(jié)果

選擇經(jīng)4℃低溫脅迫后茶樹葉片的下調(diào)表達(dá)片段Csgsf和Cscaf1及上調(diào)表達(dá)片段Cscaf2進(jìn)行RTPCR驗(yàn)證。結(jié)果見圖4。由圖4可見:Csgsf和Cscaf1在脅迫初始即表達(dá)，并隨著低溫脅迫時間的延長表達(dá)量逐漸降低;而Cscaf2在0 h表達(dá)較弱，隨著低溫脅迫時間的延長表達(dá)量逐漸增加，在脅迫48 h后達(dá)到最大。

圖4 經(jīng)低溫(4℃)脅迫不同時間后茶樹品種‘紫陽圓葉’差異片段Csgsf、Cscaf1和Cscaf2的半定量RT－PCR結(jié)果Fig.4 Semi-quantitative RT-PCR result of differential fragments Csgsf，Cscaf1 and Cscaf2 of Camellia sinensis‘Ziyangyuanye’after treated by low temperature(4℃)stress for different times

3 討 論

本研究采用mRNA差異顯示技術(shù)，對陜西地方抗寒性茶樹種質(zhì)‘紫陽圓葉’在5個不同時間段低溫脅迫處理下的cDNA進(jìn)行分析，并通過差異cDNA片段的克隆、測序和功能分析，最終獲得3個與低溫脅迫相關(guān)的片段，分別為谷氨酰胺合成酶基因片段Csgsf和在低溫脅迫下表現(xiàn)應(yīng)答的茶樹冷誘導(dǎo)基因片段Cscaf1和 Cscaf2。

谷氨酰胺合成酶(GS)為高等植物氨同化的關(guān)鍵酶。當(dāng)ATP供能時，GS將催化還原為谷氨酰胺。GS的表達(dá)受組織器官特異性以及光照、溫度、鹽離子、土壤重金屬、水分脅迫及氮源形式等因素的影響［12-13］。Teixeir等［14］的研究結(jié)果表明:經(jīng)鹽脅迫處理后，馬鈴薯(Solanum tuberosum Linn.)葉片中的 GS表達(dá)下調(diào)，根部的GS表達(dá)上調(diào)，說明鹽脅迫對馬鈴薯各器官中的GS含量有影響，其中葉片中的GS對鹽脅迫的敏感性較根部更強(qiáng)。此外，低溫也會明顯影響植物GS等氮素同化酶的活性。陸彬彬等［15］的研究結(jié)果表明:相對低溫會抑制水稻葉片中GS的活性;本研究結(jié)果也顯示:在低溫脅迫過程中Csgsf強(qiáng)度隨脅迫時間延長逐漸變?nèi)?在低溫脅迫處理過程中的前8 h，Csgsf表達(dá)活性較高，但隨脅迫時間的延長，至脅迫16 h時其表達(dá)量明顯下降。據(jù)此可推測:低溫脅迫過程中茶樹葉片中谷氨酰胺合成酶基因的表達(dá)量隨脅迫時間的延長逐漸降低，呈下調(diào)趨勢，這與 Rana等［16］對4℃低溫處理后茶樹葉芽中GS的表達(dá)狀況的研究結(jié)果一致。Rana等［16］的研究結(jié)果還表明:GS除對低溫脅迫有響應(yīng)外，在經(jīng)過干旱和高溫等非生物因子脅迫處理后，茶樹葉芽中GS的表達(dá)量也均下調(diào)。推測茶樹GS基因啟動子區(qū)域可能有脅迫響應(yīng)元件，從而導(dǎo)致基因表達(dá)量降低。

大多數(shù)植物葉片中包含2類GS，即胞液型GS(GS1)和葉綠體型GS(GS2)，其中GS1主要同化內(nèi)源性蛋白質(zhì)降解和氨基酸分解代謝產(chǎn)生的氨［17］。本研究結(jié)果和Rana等［16］的研究結(jié)果均表明:經(jīng)低溫脅迫后茶樹葉片中的GS表達(dá)均減弱。其原因可能是:在溫度下降后葉片細(xì)胞中蛋白質(zhì)分解代謝和光呼吸作用均減弱，導(dǎo)致內(nèi)源性蛋白質(zhì)和由光呼吸產(chǎn)生的均減少，進(jìn)一步引起GS表達(dá)量下調(diào)、酶活性下降。相關(guān)的具體生化途徑和基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚待進(jìn)一步深入研究。

干旱脅迫與低溫脅迫對植物生理生化過程以及基因表達(dá)等的影響作用相似［18］，植物抗寒相關(guān)基因包括冷脅迫專一誘導(dǎo)基因和低溫誘導(dǎo)基因，其中，專一誘導(dǎo)基因只能被冷處理誘導(dǎo)［19］，而低溫誘導(dǎo)基因不僅能對低溫處理快速應(yīng)答還能被水脅迫、短日照和ABA等脅迫誘導(dǎo)，如擬南芥〔Arabidopsis thaliana(Linn.)Heynh.〕的 RC12A 和 RC12B 等基因［20］。本研究中，茶樹冷誘導(dǎo)基因片段Cscaf2與茶樹干旱脅迫誘導(dǎo)下表達(dá)的cDNA同源性高達(dá)100%，由此可推測Cscaf2是對干旱和低溫等脅迫均有表現(xiàn)應(yīng)答的基因片段。在基因數(shù)據(jù)庫中未能檢出茶樹冷誘導(dǎo)基因片段Cscaf1的同源序列，推測其可能是與冷脅迫相關(guān)的基因片段，具體功能還有待進(jìn)一步研究。

低溫是影響茶樹生長發(fā)育、制約茶葉產(chǎn)業(yè)發(fā)展的最重要的非生物因子之一。陜西地方茶樹品種主要種植于秦巴山區(qū)，因長期適應(yīng)低溫環(huán)境，比南方種植的茶樹品種的抗寒性相對更強(qiáng)。由于差異顯示技術(shù)的局限性，本研究未能從抗寒茶樹品種‘紫陽圓葉’中克隆獲得與茶樹抗寒直接有關(guān)的基因。但根據(jù)研究結(jié)果并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，Csgsf、Cscaf1和Cscaf2這3個cDNA片段的確參與了茶樹對低溫脅迫的應(yīng)答，這3個片段的獲得不僅有助于茶樹抗寒性分子機(jī)制的深入研究，也為今后地方優(yōu)良茶樹種質(zhì)資源的合理利用以及遺傳改良奠定了一定的研究基礎(chǔ)。

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