黃瓜籽乙酸乙酯提取物對人成骨肉瘤細(xì)胞骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的影響

李 娜，潘 志，唐 燕，陳 新，宋 寧，張洪長*

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)研發(fā)中心,長春 130117；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長春 130117)

·實驗研究·

黃瓜籽乙酸乙酯提取物對人成骨肉瘤細(xì)胞骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的影響

李 娜1，潘 志1，唐 燕1，陳 新2，宋 寧2，張洪長1*

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)研發(fā)中心,長春 130117；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長春 130117)

目的 通過測定骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)的表達(dá),探討黃瓜籽乙酸乙酯提取物(CSA)對人成骨肉瘤(MG63)細(xì)胞的活性的影響。方法 采用體外培養(yǎng)MG63細(xì)胞,給予CSA與MG6置于37 ℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中共同孵育48 h,MTT比色法檢測黃瓜籽提取物對細(xì)胞活性的影響；生化法檢測ALP含量，ELISA法定量檢測BMP-2的含量；免疫組化法測定BMP-2表達(dá)。結(jié)果 MTT法，CSA具有明顯促進(jìn)MG63細(xì)胞活力(Plt;0.01);免疫組織化學(xué)染色法，CSA細(xì)胞中的BMP-2的表達(dá)量明顯高于空白組;CSA組ALP和BMP-2含量高于空白組(Plt;0.01)。結(jié)論 CSA對MG63具有保護(hù)作用，能夠有效的提高M(jìn)G63細(xì)胞的生存率，其機(jī)制可能與促進(jìn)BMP-2表達(dá)、升高ALP和BMP-2的含量有關(guān)。

黃瓜籽；ALP；BMP-2

黃瓜籽，異名哈利蘇，為葫蘆科黃瓜屬黃瓜CucumissativusL.的干燥成熟種籽。黃瓜籽具有續(xù)筋接骨、祛風(fēng)的功效，主治骨折筋傷，風(fēng)濕痹病[1]?，F(xiàn)代研究證實，黃瓜籽具有促進(jìn)人體骨骼再生的功效[2]，黃瓜籽多肽具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化及抗骨質(zhì)疏松作用[3]；在民間治療骨科疾病已有悠久的歷史，廣泛用于接骨壯骨及補(bǔ)鈣。本實驗利用ELISA法(HE染色及免疫組織化學(xué)方法測定)檢測堿性磷酸酶(ALP)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)的含量,免疫組化測定BMP-2的表達(dá)變化，探討黃瓜籽提取物促進(jìn)骨折愈合在分子水平的作用機(jī)制，為黃瓜籽治療骨折的研究及開發(fā)治療骨折的新藥奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥品制備 黃瓜籽提取物由長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院配制，將黃瓜籽粉碎成粗粉，采用仿生化提取法[4]，乙酸乙酯系統(tǒng)分離，得到有效部位(CSA)，配成濃度為1 mg/mL的檢測樣品溶液，置2 ℃冰箱備用。

1.2 細(xì)胞株、主要試劑及儀器 MG63細(xì)胞(購于吉林省腫瘤醫(yī)院)，胎牛血清、1640培養(yǎng)基和胰蛋白酶均購自于GibcoBRL公司。兔抗人BMP-2抗體、羊抗兔二抗購自于Pe-protech公司，DAB KIT顯色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)。堿性磷酸酶(ALP)生化檢測試劑盒購于南京建成，BMP-2ELISA試劑盒購自美國Ramp;D公司。CO2培養(yǎng)箱購自Thermo公司，550型酶標(biāo)儀購自美國BIO-RAD公司，Leica石蠟切片機(jī)，Leica攤片機(jī)，Leica包埋機(jī)均為德國Leica公司產(chǎn)品。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 將MG63細(xì)胞置于含有10%胎牛血清和青鏈霉素各100 U/mL的1640培養(yǎng)基,在37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞長至80%融合時進(jìn)行實驗，常規(guī)換液以維持細(xì)胞處于對數(shù)生長期狀態(tài)。

1.4 MTT法測定細(xì)胞活力 將MG63細(xì)胞接種于96孔板，每孔5×104/mL的細(xì)胞懸浮液200 μL、37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。當(dāng)細(xì)胞完全貼壁生長后，吸棄培養(yǎng)液，分別加入不同質(zhì)量濃度(10、100、500 μg/mL)的含藥培養(yǎng)基，以10%FCS-DMEM培養(yǎng)基為對照，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。加入MTT(質(zhì)量濃度為5 g·L)，每孔20 μL，置于培養(yǎng)箱孵育4 h后甩板，每孔加入150 μL DMSO使其顯色，37 ℃振動孵育10 min，使結(jié)晶溶解完全，置于酶標(biāo)儀490 nm處檢測吸光度(OD值)。

1.5 生化指標(biāo)檢測 調(diào)整細(xì)胞體積濃度約1×105/mL，接種于6孔板內(nèi)。待細(xì)胞融合達(dá)到70%時，取MTT法篩選最佳給藥劑量進(jìn)行給藥(100 μg/mL)，用PBS沖洗3次，加入0.2 mL裂解液，用刮刀將細(xì)胞刮下，移至EP管中，13 000 r/min離心30 min，收集上清按試劑盒說明要求，檢測細(xì)胞上清液中ALP和BMP-2的含量。

1.6 免疫組織化學(xué)法 調(diào)整細(xì)胞體積濃度1×105/mL，接種于6孔板(內(nèi)置無菌蓋玻片)內(nèi)。待細(xì)胞融合達(dá)到70%時，按照MTT法篩選最佳給藥劑量100 μg/mL給藥，用PBS反復(fù)洗滌3次，甲醇固定30 min,去除固定液，PBS洗滌，4%多聚甲醛固定，0.1%TritonX100作用20 min，加入BMP-2抗體(1∶50稀釋)，室溫作用1 h，二抗用PBS稀釋200倍，辣根酶標(biāo)記。DAB顯色，蘇木素復(fù)染。于熒光倒置顯微鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 CSA對MG63細(xì)胞增殖作用(OD值)影響 CSA促成骨細(xì)胞增殖作用明顯，且當(dāng)給藥質(zhì)量濃度為100 μg/mL時，促增殖作用最為明顯；當(dāng)給藥濃度為500 μg/mL時，對細(xì)胞增殖有抑制作用，說明濃度過大時有細(xì)胞毒性。提示黃瓜子微波制品的仿生化乙酸乙酯提取部位促骨細(xì)胞增殖效果最明顯。見表1。

2.2 CSA對ALP、BMP-2含量的影響 與對照組比較，給藥組的ALP含量均有升高(Plt;0.01)。由此可知，CSA均能夠有效的促進(jìn)成骨細(xì)胞MG63對ALP、BMP-2的分泌，從而促進(jìn)骨形成，起到防治骨質(zhì)疏松的作用。見表2。

表1 CSA對MG63細(xì)胞增殖作用(OD值)影響

注：與對照組比較，#Plt;0.05。

表2 CSA對ALP，BMP-2含量的影響

注：與對照組比較，##Plt;0.01。

2.3 BMP-2免疫組織化學(xué)染色 BMP-2免疫組織化學(xué)染色顯示，CSA處置細(xì)胞后,給藥組細(xì)胞BMP-2呈明顯陽性,胞漿內(nèi)分布著棕黃色顆粒表達(dá)增強(qiáng)。說明CSA具有保護(hù)MG63細(xì)胞的作用。見圖1。

A:對照組；B:CSA圖1 各組MG63中BMP-2的表達(dá)(免疫組織化學(xué)，×200)

3 討論

近年來，由于基因技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用，人們對骨折愈合的認(rèn)識已從細(xì)胞生物學(xué)向分子生物學(xué)水平深化，并隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，已經(jīng)認(rèn)識到骨折愈合與多種生物因子有關(guān)[5-7]。隨著骨誘導(dǎo)理論的提出,人們發(fā)現(xiàn)BMP對未分化間充質(zhì)細(xì)胞具有獨特的誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化并進(jìn)而形成新骨的作用[8-9]。骨折愈合主要受局部骨生長因子的調(diào)控[10-11]，中藥能有效地促進(jìn)骨折愈合過程中BMPS的表達(dá)[12-13]，影響骨折愈合過程中BMP-2的合成，縮短骨折愈合的進(jìn)程[14-16]，研究證明中藥能誘導(dǎo)生物體內(nèi)BMP的合成。本實驗圍繞黃瓜籽有效成分的發(fā)現(xiàn)及其可能的對促進(jìn)成骨細(xì)胞內(nèi)BMP-2合成及其表達(dá)影響,進(jìn)行了研究。MTT結(jié)果顯示，黃瓜子微波制品的仿生化乙酸乙酯提取部位對MG63細(xì)胞具有保護(hù)作用，能夠有效的提高M(jìn)G63細(xì)胞的生存率；黃瓜籽乙酸乙酯提取部位具有增加成骨細(xì)胞內(nèi)BMP-2表達(dá)的作用,促進(jìn)ALP的合成，提示黃瓜籽促進(jìn)骨折愈合的機(jī)制可能與促進(jìn)BMP-2表達(dá)、升高ALP的含量有關(guān)，同時為黃瓜籽可促進(jìn)成骨細(xì)胞內(nèi)BMP-2的表達(dá)提供了佐證，也為中藥治療骨折的研究及開發(fā)治療骨折的新藥提供了理論基礎(chǔ)，值得進(jìn)一步的研究。

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EffectofEthylAcetateExtractofCucumisSativusSeedonBMP-2ofMG63

LI Na1,PAN Zhi1,TANG Yan1,CHEN Xin2,SONG Ning2,ZHANG Hongchang1*

(1.Center of Research and Development,Changchun University of Traditional Chinese Medicine,Changchun 130117,China;2.School of Pharmacy, Changchun University of Traditional Chinese Medicine,Changchun 130117,China)

ObjectiveTo evaluate the expression of bone morphogenetic protein (BMP-2) of ethyl acetate extract of cucumis sativus seed on the Human Osteosarcoma MG63 cells.MethodMG63 cells with CSA were in vitro at 37 ℃ and 5% CO2saturated humidity incubator in common incubation 48 h.Cell viability was measured by MTT assay,and expression of BMP-2 was performed by the method of immunohistochemistry and ELISA.ALP was detected by Biochemical method.ResultCSA can obviously promote MG63 cells vitality(Plt;0.01) by MTT.The amount of the expression of BMP-2 in the CSA group wasobviously higher than that of blank group by Immunohistochemical staining.ALP and BMP-2 level of CSA group were higher than that of blank group (Plt;0.01).ConclusionCSA has a protective effect and can effectively improve the cell survival.Its mechanism may be related to promotion of the expression of BMP-2 and increase of the content of ALP and BMP-2.

cucumis sativus seed;ALP;BMP-2

R285.5

B

1003-5699(2013)12-1255-03

吉林省衛(wèi)生廳科研課題(2009S012)；吉林省中醫(yī)藥管理局課題(2010-071)。

李 娜(1978-),女，藥學(xué)博士。研究方向：分子藥理學(xué)研究。

*

張洪長，電話：0431-86172082，電子信箱：zhc1961@hotmail.com。

2013-11-04)