射干麻黃湯對哮喘大鼠氣道重塑及TNF-α、IL-17的影響

曹 琿

(南京市胸科醫(yī)院 胸外科，南京 210029)

射干麻黃湯對哮喘大鼠氣道重塑及TNF-α、IL-17的影響

曹 琿

(南京市胸科醫(yī)院 胸外科，南京 210029)

目的 觀察射干麻黃湯對哮喘大鼠模型氣道重塑和TNF-α、IL-17的影響。方法 采用卵蛋白(OVA)聯(lián)合霧化吸入的方法建立哮喘大鼠模型，50只SD大鼠隨機分為5組。觀察治療后各組大鼠的TNF-α、IL-17含量以及大鼠氣道壁厚度。結果 地塞米松組及中藥組大鼠TNF-α(1.29±0.16,0.84±0.19)、IL-17(1.42±0.44，0.75±0.27)與模型空白組TNF-α(1.68±0.21)、IL-17(2.19±0.34)相比較明顯降低(Plt;0.01),且中藥組降低的幅度明顯大于地塞米松組(Plt;0.05)；在氣道壁厚度改善方面,中藥組的療效明顯好于地塞米松組,差異對比具有統(tǒng)計學意義(Plt;0.05)。結論 射干麻黃湯可以有效抑制哮喘大鼠的TNF-α、IL-17質量濃度達到抑制炎癥的目的,從而緩解哮喘大鼠氣道重塑的進程。

喘證;氣道重塑;TNF-α;IL-17;射干麻黃湯；大鼠

支氣管哮喘是目前最常見的慢性肺系疾病之一，它是由嗜酸性粒細胞、肥大細胞等多種炎性細胞、結構細胞參與的氣道慢性炎癥疾病[1]，在哮喘發(fā)生的過程中不單單存在氣道炎癥，還會出現(xiàn)氣道結構異?，F(xiàn)象[2]。目前認為哮喘的發(fā)生是遺傳、環(huán)境、免疫等多因素共同導致氣管內(nèi)壁的慢性炎癥[3]，研究認為哮喘的發(fā)生主要是由于Th1/Th2之間的平衡狀態(tài)被打破,從而引發(fā)一系列哮喘的臨床癥狀[4-5]。由于炎癥學說的確立，抗炎治療得到了廣泛的應用，但很多藥物只是單純的緩解癥狀，并不能有效逆轉哮喘的發(fā)生，同時長期應用抗炎藥物還會帶來一系列的不良反應，因此研究人員開始關注中醫(yī)藥在哮喘治療過程中的作用。我們研究發(fā)現(xiàn),腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及白細胞介素-17(IL-17)在哮喘的發(fā)病及氣道重塑過程中發(fā)揮促炎的作用，射干麻黃湯是治療哮喘名方，本研究通過建立哮喘大鼠模型,觀察射干麻黃湯對哮喘大鼠血清中TNF-α、IL-17的影響及對氣道重塑的影響，探討射干麻黃湯治療哮喘的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級SD大鼠50只，體質量(220±20) g，由南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。

1.2 實驗藥物 射干麻黃湯組成:射干12 g，麻黃12 g，半夏12 g，紫菀9 g，款冬花9 g，細辛3 g，五味子3 g，生姜9 g，大棗3枚組成。所有中藥由江蘇省中醫(yī)院藥劑科提供,采用自動煎藥機煎取，濃縮為1 mL含生藥0.96 g(低劑量組)、3.84 g(高劑量組)2個組別；地塞米松針劑(5 mg/mL)，辰欣藥業(yè)股份有限公司，國藥準字H37021969；0.9% NaCl溶液，南京小營藥業(yè)集團；水為重蒸餾高純水。

1.3 實驗試劑 卵蛋白(OVA)，美國Sigma公司;氫氧化鋁，上海鑫貴源化工有限公司;大鼠TNF-α、IL-17酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司。

1.4 實驗儀器 冰凍切片機，浙江省金華科迪儀器設備有限公司;RM2135型石蠟切片機,德國LEICA公司；XL型全自動染色機，德國；SZ-93自動雙重純水蒸餾器,上海亞榮生化儀器廠；MPIAS-500彩色病理圖文分析系統(tǒng)；超聲霧化器，江蘇魚躍醫(yī)療設備公司。

1.5 動物分組 50只SD大鼠隨機分為5組：正常組(A組)、模型空白組(B組)、地塞米松組(C組)、射干麻黃湯低劑量組(D組)、射干麻黃湯高劑量組(E組)。

1.6 動物模型制備 參照文獻[6-7]采用卵清蛋白注射和霧化吸入的方法制備大鼠支氣管哮喘模型。將1 mg OVA與200 mg氫氧化鋁溶于生理鹽水中，配成1 mL的混懸液。在實驗的第1、7、14 d采用腹腔注射OVA混懸液0.1 mL致敏。從第15天開始用1%OVA的生理鹽水霧化激發(fā)，隔日1次，每次30 min，共持續(xù)4周。當大鼠出現(xiàn)煩躁不安、呼吸加快、口唇紫紺、大小便失禁等癥狀，說明哮喘大鼠模型制備成功。第5周開始進行哮喘治療，C組大鼠給予地塞米松1 mg/(kg·d)灌胃治療，D組大鼠給予含生藥量0.96 g/(kg·d)的射干麻黃湯灌胃治療，E組大鼠予含生藥量3.84 g/(kg·d)的射干麻黃湯灌胃，A組及B組給予生理鹽水灌胃治療，持續(xù)治療20 d。

1.7 標本收集 在末次治療24 h后，處死大鼠。抽取大鼠股動脈血液2 mL，離心20 min(3 000 r/min)，分離血清后置于-80 ℃保存。按照ELISA試劑盒說明書進行檢測TNF-α、IL-17水平。處死大鼠后迅速取出左支氣管置于福爾馬林溶液中固定，進行蘇木精-伊紅(HE)染色，采用醫(yī)學圖像分析軟件測定支氣管壁的厚度，用以衡量氣道重塑的程度[8]。

2 結果

2.1 各組大鼠霧化吸入后行為改變情況 A組大鼠行為無任何異常表現(xiàn)，B組大鼠在激發(fā)10 min后出現(xiàn)呼吸加快加深、躁動不安，后期可見點頭呼吸、前肢縮抬，嚴重者可出現(xiàn)哮鳴音、皮膚紫紺等。C組、D組、E組大鼠均出現(xiàn)類似B組大鼠癥狀，但較B組減輕,大鼠行為改變程度為C組gt;D組gt;E組。

2.2 氣道形態(tài)學測定結果比較

2.2.1 WAt(管壁總面積)/Pbm(支氣管基底膜周徑)、平滑肌面積(WAm)/Pbm B、C、D、E組與A組相比氣道壁出現(xiàn)明顯增厚(Plt;0.01)；C、D、E組的氣道壁厚度明顯低于B組(Plt;0.05)；D、E組的氣道壁厚度明顯低于C組(Plt;0.05)，與A組相比氣道壁厚度無明顯差異(Pgt;0.05)。見表1。

2.2.2 內(nèi)壁面積(WAi)/Pbm B與A組相比氣道壁出現(xiàn)明顯增厚(Plt;0.05)；C、D、E組與A組相比氣道壁厚度無明顯差異(Pgt;0.05)。見表1。

注：與正常組相比，#Plt;0.01；與模型空白組相比，△Plt;0.01；與地塞米松組相比，◇Plt;0.05。

2.3 各組大鼠血液指標比較情況 B、C、D、E組的TNF-α、IL-17水平較A組明顯增高(Plt;0.01)，提示哮喘模型大鼠制備成功；C、D、E組的TNF-α、IL-17水平明顯低于B組(Plt;0.05或Plt;0.01)；D、E組的TNF-α、IL-17水平明顯低于C組，差異具有統(tǒng)計學意義(Plt;0.05)；D、E2組的TNF-α、IL-17水平之間無明顯差異(Plt;0.05)。見表2。

表2 各組大鼠治療后血液學指標變化情況 ng/mL

注：與正常組相比，#Plt;0.01；與模型空白組相比，△Plt;0.01；與地塞米松組相比，▲Plt;0.05。

3 討論

支氣管哮喘是以呼吸道高反應性和慢性炎癥為主要特征的慢性呼吸道疾病，調(diào)查表明：支氣管哮喘的發(fā)病率約為18%，呈逐年上升的趨勢，每年大約有18萬人死于該病[9-10]。實驗研究[11]證明，哮喘最重要的免疫學異常是Th1/ Th2的失衡，主要體現(xiàn)在Th2細胞數(shù)目的增多及功能的亢進[11]。在支氣管哮喘動物模型或者是臨床哮喘患者中，都會出現(xiàn)Th1/Th2的失衡狀態(tài),此時兩者釋放的細胞因子都會導致哮喘特征性病理生理的變化。但是隨著研究的進一步深入,研究人員發(fā)現(xiàn)，Th1/Th2失衡理論并不能完全解釋哮喘的進程，而Th17細胞亞群的發(fā)現(xiàn)恰恰彌補了這個缺陷，其分泌的IL-17與哮喘的發(fā)生有著密切關系。

IL-17是一種前炎癥因子，在機體中同時參與固有免疫和獲得性免疫反應過程[12]。國外研究報道提示IL-17可以通過刺激間葉細胞來分泌二級前炎癥因子，使得中性粒細胞在炎癥區(qū)域內(nèi)聚集。[13]國外研究顯示IL-17可以明顯促進嗜酸性粒細胞的趨化，并使其釋放大量的細胞因子和化學介質,增強機體的炎癥反應。[14]TNF-α是由單核巨噬細胞產(chǎn)生的一種多肽調(diào)節(jié)因子，其可以引起支氣管的高反應性[15]，同時它還可像IL-17一樣聚集支氣管內(nèi)的炎癥細胞,產(chǎn)生多種炎癥遞質。研究顯示，TNF-α可以上調(diào)血管內(nèi)皮細胞、嗜酸性粒細胞膜上表達的黏附分子，而這些黏附分子與氣道高反應性的形成密切相關。

本實驗采用OVA聯(lián)合霧化吸入的方法復制哮喘大鼠模型,觀察射干麻黃湯與地塞米松對哮喘大鼠作用的差別。結果顯示，中藥組的黏膜、平滑基層以及氣道壁都出現(xiàn)顯著的增厚，說明射干麻黃湯可以抑制哮喘氣道重塑，改善患者臨床癥狀，且其劑量越高，抑制氣道重塑的效果越明顯。治療組哮喘大鼠TNF-α、IL-17的含量明顯低于模型空白組,治療后中藥組大鼠的炎癥因子已經(jīng)開始逐漸接近正常組,其降低TNF-α、IL-17的速度明顯快于地塞米松組。但是本實驗只是單純的從TNF-α、IL-17去探討了射干麻黃湯對哮喘大鼠的作用機理,對于射干麻黃湯的最佳作用劑量、加減作用、對于氣道重塑的影響的有效部位等更加復雜的問題，需要深入細致的研究。

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EffectofSheganMahuangDecoctiononAirwayRemodelingandExpressionofTNF-αandIL-17inAsthmaticRats

CAO Hui

(Department of Chest Surgery,Nanjing Thoracic Hospital,Nanjing 210029,China)

ObjectiveTo investigate the influence ofSheganMahuangDecoctionon airway remodeling and expression of TNF-αand IL-17 in asthmatic rats.MethodsRats were sensitized and challenged with ovalbumin(OVA) to establish the asthmatic model.Fifty SD rats were randomly divided into five groups.The expression of TNF-α and IL-17 in lung tissues were detected by immunohistochemistry.The paraffin embedded sections of lung tissue were observed.ResultsExpression levels of TNF-α and IL-17 in the epithelial cells of bronchi ofSheganMahuangDecoctiongroup were decreased obviously than in dexamethasone group(Plt;0.05) and in the control group(Plt;0.01).ConclusionRepeated exposure of allergen induces airway inflammation and remodeling.SheganMahuangDecoctionrestrain the increase of thickness of total airway wall and smooth muscle by inhibiting TNF-α and IL-17 degranulation in lung tissue.

bronchial asthma;airway remodeling;TNF-α;IL-17;SheganMahuangDecoction;rats

R285.5

A

1003-5699(2013)12-1258-03

曹 琿(1978-),男，大學本科，主治醫(yī)師。研究方向：心胸外科。

2013-04-25)