影響顯微攝影清晰度的關(guān)鍵操作技術(shù)

王小平，張 凌，王亞平，許佳捷

第二軍醫(yī)大學(xué):1基礎(chǔ)部數(shù)理教研室;2訓(xùn)練部教育技術(shù)中心，上海 200433

顯微攝影是生物、臨床醫(yī)學(xué)普遍開(kāi)設(shè)的基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)一般采用黑白膠卷或相紙感光、顯影和定影等方法，將顯微鏡視野中所觀察的樣本真實(shí)地記錄下來(lái)，旨在使學(xué)生掌握顯微攝影的基本原理和操作技術(shù)。然而，受沖洗時(shí)間等條件的限制，有關(guān)屈光度、聚焦、聚光鏡孔徑光闌等的操作與影像清晰度之間的關(guān)系，以及影像清晰度缺乏客觀、量化的指標(biāo)或參數(shù)，難以揭示或表述顯微攝影操作流程與影像清晰度的內(nèi)在關(guān)系，造成學(xué)生拍攝的照片普遍質(zhì)量不高。

該文結(jié)合文獻(xiàn)研讀和攝影實(shí)踐，引用鏡頭評(píng)價(jià)MFT曲線中的對(duì)比度(銳度)和分辨率等概念和定義，用以直觀和量化圖像清晰度的概念，并對(duì)顯微攝影操作中的關(guān)鍵步驟和顯微照片清晰度的關(guān)系作進(jìn)一步探討，以期獲得一些對(duì)醫(yī)學(xué)顯微攝影人科研和教學(xué)有益的結(jié)論。

1 圖像(影像)清晰度的定義

一般認(rèn)為，清晰度是影像邊緣的銳利程度，主要包括像素、亮度(在黑白圖像中等同于灰度)、對(duì)比度等［1］。也有人把清晰度定義為影像系統(tǒng)對(duì)畫(huà)面細(xì)部還原能力的綜合評(píng)價(jià)，包括解像力、顆粒度、反差和影調(diào)再現(xiàn)等方面［2］。國(guó)外的一些攝影教程則認(rèn)為，影像清晰度是人的視覺(jué)對(duì)清晰程度所做出的主觀判斷，其中還必須包括影像反差以及實(shí)際呈現(xiàn)精微細(xì)節(jié)的多少［3］。

鏡頭的調(diào)制傳遞函數(shù)(MTF)曲線是對(duì)鏡頭解像力的一個(gè)定量描述，是鏡頭成像質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)。用于鏡頭解像力的測(cè)試標(biāo)版如圖1所示。這個(gè)黑白條紋包含了描述影像清晰度的兩個(gè)基本要素:銳度(acutance)是指黑白色調(diào)邊界的鋒利或銳利程度，即黑白邊界處的對(duì)比度，是描述邊界處影像信息過(guò)渡的快慢，高銳度導(dǎo)致信息的迅速過(guò)渡從而使得邊界清晰可見(jiàn)(如圖2所示):左圖銳度高于右圖;分辨率(resolution)描述的是對(duì)空間細(xì)節(jié)分辨的能力，即單位長(zhǎng)度包含的黑白條紋數(shù)目，如果能把相鄰非常近的線條分開(kāi)，我們就說(shuō)這個(gè)相機(jī)或鏡頭的分辨率高，圖3左邊分辨率要高于右邊。分辨率常用“空間頻率”(簡(jiǎn)稱(chēng)頻率)來(lái)定量描述，圖1中空間頻率是變化的，從左往右，黑白條紋寬度逐漸變窄，間隔逐漸變小;空間頻率逐漸升高。左邊是低頻，右邊是高頻。

圖1 鏡頭解像力的測(cè)試標(biāo)版［4］

圖2 高低銳度對(duì)照?qǐng)D［4］

圖3 高低分辨率示意圖［4］

MTF值代表的是在一定的條紋空間頻率下對(duì)比度的復(fù)制率。在MTF曲線中，橫軸是空間頻率，縱軸是對(duì)比度的“復(fù)制率”，即MTF值。比如:在某個(gè)給定的頻率位置，原物的對(duì)比度是10，如果鏡頭成像的對(duì)比度是10，那么MTF=1(或100%);如果鏡頭成像的對(duì)比度是5，那么 MTF=0.5(或50%)。理想鏡頭的MTF曲線在低頻端的MTF值接近于1，隨著頻率增加，MTF值逐漸降低，因?yàn)檠苌洮F(xiàn)象的影響開(kāi)始變得重要;在高頻端，衍射的影響強(qiáng)烈到影像無(wú)法解析的程度，MFT值趨近于0，即黑白條紋無(wú)法分辨，分辨率變成0。除鏡頭本身的制作質(zhì)量，MTF曲線還依賴(lài)于光圈值和焦距。

顯然，鏡頭MTF曲線中描述清晰度的兩個(gè)參數(shù)也可用于顯微照片質(zhì)量的評(píng)價(jià)和清晰度的定義，銳度和分辨率都可以量化，并且形象直觀，初學(xué)者使用測(cè)試標(biāo)版進(jìn)行拍攝練習(xí)，可以很好地感知清晰度的概念以及關(guān)鍵操作對(duì)清晰度的影響。

2 照明系統(tǒng)的調(diào)節(jié)

“用光是攝影的語(yǔ)言”［5］，顯微攝影因其實(shí)際視場(chǎng)面積的緣故，樣品照明是決定顯微照片質(zhì)量的重要參數(shù)。1893年德國(guó)蔡司的柯勒(August Kohler)研發(fā)了一種完善的透射照明方法，這一方法能使樣品獲得均勻、充分明亮的照明，防止雜散光對(duì)成像的影響，并使樣品受熱最小而成為一種最佳照明的方法。因此，顯微攝影的首要工作就是照明光路系統(tǒng)的調(diào)整，而按照柯勒照明系統(tǒng)的要求和步驟來(lái)進(jìn)行，就是關(guān)鍵之所在［6］。

2.1 柯勒照明法［6］

圖4 庫(kù)勒照明系統(tǒng)的原理圖

圖4是庫(kù)勒照明系統(tǒng)的原理圖。光源的燈絲1經(jīng)聚光鏡2及可變視場(chǎng)光闌3后，燈絲像a第一次落在聚光鏡孔徑光闌4的平面處，此處也是聚光鏡5的前焦平面，而光源發(fā)光體的所有光點(diǎn)匯集起來(lái)，便在聚光鏡的孔徑光闌上形成了發(fā)光體的完整像。從光學(xué)系統(tǒng)的原理來(lái)看，就好像把光源的發(fā)光體正好擺在聚光鏡5下方的前焦平面上，出射的照明光，就是發(fā)光體上所有發(fā)光點(diǎn)從各個(gè)方位上匯集起來(lái)的一束平行光，它穿越樣品使樣品上獲得充分的照明，因而從物鏡7成像的視域中看不到燈絲的像，即不出現(xiàn)燈絲的條紋。包含了光源燈絲像與孔徑光闌像的平行照明光束，則由物鏡7匯聚成像于物鏡的后焦平面處，即出瞳8(只要把目鏡從目鏡筒上拔出觀察，就可以看到這兩個(gè)像)。此外，照明的熱焦點(diǎn)不在被檢樣品的平面處，即使長(zhǎng)時(shí)間的照明，也不致?lián)p傷被檢樣品。

2.2 視場(chǎng)光闌調(diào)節(jié)［7］

視場(chǎng)光闌由10片或更多的葉片組成一個(gè)接近于圓形的多邊形通光孔狀屏障，從顯微鏡的樣品視域6中可以看到視場(chǎng)光闌經(jīng)聚光鏡所成的多邊形的像。視場(chǎng)光闌3位于顯微鏡的底座上，其位置處在聚光鏡5的二倍焦距以外。聚光鏡的托架上通常都設(shè)有聚光鏡高低位置的調(diào)節(jié)機(jī)構(gòu)，調(diào)節(jié)聚光鏡的高低位置就可把視場(chǎng)光闌成像于樣品平面上，在樣品調(diào)焦清晰的同時(shí)也可看到清晰的視場(chǎng)光闌像。

視場(chǎng)光闌可調(diào)控投射到聚光鏡的照明光束直徑的大小;控制雜散光在成像光路系統(tǒng)中的影響，特別是免除雜散光對(duì)于顯微照相系統(tǒng)的干擾，使顯微照相的底片不至于蒙上一層灰霧;視場(chǎng)光闌對(duì)成像反差的影響則較為次要，不影響顯微鏡的分辨率，也不影響物鏡或聚光鏡的數(shù)值孔徑。

2.3 聚光鏡系統(tǒng)調(diào)節(jié)［7］

聚光鏡系統(tǒng)可由聚光鏡本體、前端透鏡和聚光鏡孔徑光闌4組成，該系統(tǒng)總是裝于顯微鏡載物臺(tái)的下方介于視場(chǎng)光闌與樣品之間，故也叫臺(tái)下聚光鏡。聚光鏡孔徑光闌也是由10片或更多葉片組成的一個(gè)接近于圓形的多邊形通光孔狀屏障，調(diào)節(jié)聚光鏡孔徑光闌:可以影響顯微鏡作觀察時(shí)的分辨率;直接控制顯微照相底片上的反差;可用來(lái)調(diào)節(jié)聚光鏡的數(shù)值孔徑，使與所使用的物鏡數(shù)值孔徑做出適當(dāng)?shù)呐浜?，以取得最佳或最大分辨率?/p>

聚光鏡的數(shù)值孔徑與物鏡的數(shù)值孔徑對(duì)于顯微鏡分辨率的影響，具有同等的重要性。不同放大倍數(shù)的物鏡其數(shù)值孔徑不同，因此，只有改變聚光鏡的數(shù)值孔徑來(lái)做出適當(dāng)配合以達(dá)到最佳分辨率。理論上要求兩者的數(shù)值孔徑應(yīng)該相等(因顯微樣品的反差通常較低)，而實(shí)踐證明，只要把孔徑光闌像的大小調(diào)到等于物鏡出射光瞳直徑的2/3～4/5，即66%～80%時(shí)(如圖5所示)，才可以達(dá)到最佳的分辨率與最佳的反差。

圖5 聚光鏡孔徑光闌的調(diào)節(jié)

3 屈光度調(diào)節(jié)和調(diào)焦

在光學(xué)成像系統(tǒng)中，只有當(dāng)成像平面與物體平面共軛時(shí)，即圖像處于聚焦?fàn)顟B(tài)，圖像最清晰。此時(shí)稱(chēng)成像平面為聚焦平面。離聚焦平面越遠(yuǎn)，圖像越不清晰。

3.1 屈光度調(diào)節(jié)

圖6 屈光度的調(diào)節(jié)

屈光度調(diào)節(jié)又稱(chēng)視度調(diào)節(jié)，是考慮使用者在不方便佩帶眼鏡觀察時(shí)個(gè)人眼睛的視力差異，而設(shè)置的具有屈光度調(diào)節(jié)裝置—側(cè)視目鏡取景器，其原理如圖6所示:筒狀側(cè)視目鏡取景器由數(shù)片透鏡和分劃板(玻璃屏)組成。近眼端為屈光度調(diào)節(jié)環(huán)，可左右轉(zhuǎn)動(dòng)用于變換透鏡間距，改變焦點(diǎn)距離。調(diào)節(jié)環(huán)旋轉(zhuǎn)調(diào)節(jié)的最大范圍為±5屈光度(1屈光度相當(dāng)于眼鏡的100度)。經(jīng)過(guò)調(diào)節(jié)，近視或遠(yuǎn)視眼在500度以內(nèi)均可裸視取景對(duì)焦。

側(cè)視目鏡取景器內(nèi)的分劃板上刻有雙十字線，分劃板本身在光路中的位置是固定的，并且與照相感光底片為一對(duì)共軛焦平面，即:若在分劃板上成像清晰，則在感光片處也必成清晰像。

調(diào)節(jié)時(shí)，左右轉(zhuǎn)動(dòng)屈光度調(diào)節(jié)環(huán)，使側(cè)視目鏡取景器鏡筒的前端伸縮，改變焦距，直至清晰地分辨出雙十字線為止。雙十字線校準(zhǔn)后，要保持不變，以防焦距改變。當(dāng)十字被調(diào)節(jié)成雙線時(shí)，聚焦的像點(diǎn)能清晰地投射在膠片面上;如果十字線成單線，即使分劃板上影像清晰，到達(dá)感光片上光線并非聚焦，像點(diǎn)并不落在膠片面上，底片影像模糊不清。當(dāng)改變拍攝者或左右眼調(diào)換使用時(shí)，均需重新進(jìn)行屈光度的調(diào)節(jié)。

3.2 聚焦

聚焦是通過(guò)顯微鏡的粗、細(xì)調(diào)焦螺旋進(jìn)行的。轉(zhuǎn)動(dòng)顯微鏡的粗、細(xì)調(diào)節(jié)螺旋改變物鏡前透鏡和被檢物體的距離，使視場(chǎng)中物體影像的焦點(diǎn)聚于機(jī)身的膠片平面上?？v橫移動(dòng)鏡臺(tái)上制片標(biāo)本，尋找拍攝圖像，上下轉(zhuǎn)動(dòng)調(diào)焦螺旋、辨清被攝體的細(xì)微結(jié)構(gòu)。由于顯微鏡景深非常短，調(diào)焦要特別細(xì)致、準(zhǔn)確，底片影像清晰度決定于拍攝前的最終一次準(zhǔn)焦。

對(duì)比度(銳度)和分辨率有著明確的定義和量化參數(shù)，將其作為清晰度的兩個(gè)主要組成部分之后，可以建立顯微攝影操作流程與影像清晰度之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，從中可以找出影響顯微攝影質(zhì)量的關(guān)鍵操作，由此可讓學(xué)生快速掌握顯微攝影的關(guān)鍵操作，獲得清晰的顯微照片。

顯微照片的清晰度除了受制于照明方法、視場(chǎng)光闌、聚光鏡孔徑光闌、屈光度的調(diào)節(jié)和是否準(zhǔn)焦外，還與標(biāo)本的處理、載玻片和蓋玻片的材質(zhì)、厚度，濾色鏡的選取、物鏡的質(zhì)量、自動(dòng)曝光時(shí)間、照片沖印等因素有關(guān)，這些因素之間相互關(guān)聯(lián)、相互牽制，其中任何一個(gè)環(huán)節(jié)處理不當(dāng)都會(huì)影響影像的清晰度以及圖像的最佳效果。

［1］崔作龍，徐長(zhǎng)松.圖像清晰度的量化測(cè)量探究［J］.實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理，2012，29(5):49-51

［2］谷小雄.圖片的基本要素:清晰度(上)［J］.攝影與攝像，2011，(7):98-101

［3］蘭福德 M.高等攝影教程［M］.李之聰，陳曉鐘，譯.北京:中國(guó)攝影出版社，1999:17-19

［4］Cambridge in colour.Sharpness［EB/OL］.http://www.cambridgeincolour.com/tutorials/sharpness.htm，2013-04-01

［5］Hunter F，Biver S，F(xiàn)uqua P.美國(guó)攝影用光教程［M］.劉炳燕，譯.北京:人民郵電出版社，2008:1-2

［6］沈彬源.庫(kù)勒照明系統(tǒng)(Kohler illumination system)的正確調(diào)整［EB/OL］.2007-12-16.http://www.bbioo.com/instrument/54-20630-1.html，2013-04-10

［7］沈彬源.正確認(rèn)識(shí)光源的視場(chǎng)光闌與聚光鏡系統(tǒng)以及孔徑光闌的正確使用［EB/OL］.2007-12-12，http://www.bbioo.com/instrument/54-20603-7.html，2013-04-10