急性ITP患兒外周血CD4+CD25+Tr細(xì)胞及其與IL-18的相關(guān)性研究

雷樹勇 陸愛權(quán) 陳海云 張紹峰 黃富登

特發(fā)性血小板減少性紫癜（ITP）為一種嚴(yán)重疾病，有研究表明ITP患者體內(nèi)存在T淋巴細(xì)胞比例失調(diào)，預(yù)示著T細(xì)胞亞群的紊亂參與ITP的發(fā)生發(fā)展過程[1-2]。當(dāng)前ITP發(fā)病機(jī)制的焦點集中于Th1/Th2細(xì)胞之間的失衡，細(xì)胞免疫功能紊亂和細(xì)胞因子與ITP的發(fā)病及臨床進(jìn)展有關(guān)，即以Th1漂移為主，IL-18是Thl類細(xì)胞因子，作為細(xì)胞炎性介質(zhì)強(qiáng)有力的誘導(dǎo)者，通過刺激型反應(yīng)，誘導(dǎo)嚴(yán)重的免疫紊亂，從而參與一些免疫疾病的發(fā)生發(fā)展，其能否促進(jìn)或抑制Tr細(xì)胞的增殖尚未見報道。本研究對42例AITP患兒外周血中CD4+CD25+Tr細(xì)胞及IL-18水平進(jìn)行了測定，旨在進(jìn)一步探討IL-18和CD4+CD25+Tr細(xì)胞在ITP發(fā)病過程中的作用及可能機(jī)制，為AITP的臨床免疫調(diào)節(jié)治療提供一定的理論依據(jù)和新的治療途徑。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2009年1月-2010年12月在筆者所在醫(yī)院門診、住院部就診的急性特發(fā)性血小板減少性紫癜患兒42例，其中男18例，女24例，年齡0.5~8歲，平均（5.46±2.25）歲，均符合ITP的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。選取同期在本院體檢科正常兒童42例作為對照組，患兒過往沒有其他疾病病史，其中男16例，女26例，年齡3~9歲，平均（6.14±3.26）歲；兩組年齡、性別等一般資料比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 研究方法

1.2.1 外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的檢測 無菌采集ITP患兒及正常健康對照組外周靜脈血5 ml，肝素抗凝，以淋巴細(xì)胞分離液得淋巴細(xì)胞，取分離的T細(xì)胞懸液100 μl，分別加入抗CD4-FITC、抗CD25-PE的單抗各20 μl，同型對照分別為IgGI-F1TC、IgGI-PE，混勻，避光孵育25~30 min。1500 r/min離心5 min，棄上清。加入2 ml PBS洗滌液混勻，1000 r/min離心5 min，棄上清。將細(xì)胞懸浮于0.5 ml PBS洗滌液中，振蕩混勻后上流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.2 細(xì)胞因子IL-18檢測 所有受檢對象清晨空腹抽取靜脈血5 ml，離心5 min，3000 r/min，血清分離后放-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。所有?biāo)本采集前3個月均未接受過成分血小板輸注和任何免疫抑制劑。以酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）定量檢測血清IL-18水平，試劑盒由Biosource公司提供，嚴(yán)格按說明書中的步驟進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 急性ITP組與對照組外周血Tr細(xì)胞及血清IL-18水平比較 與正常對照組相比，急性ITP患兒外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量及與CD4+細(xì)胞的比例均明顯降低，而血清IL-18水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），見表1。

表1 急性ITP組與對照組外周Tr細(xì)胞的數(shù)量及血清IL-18水平比較（±s）

表1 急性ITP組與對照組外周Tr細(xì)胞的數(shù)量及血清IL-18水平比較（±s）

*P<0.05，△P<0.01，與對照組比較

組別Tr細(xì)胞（%）CD4+T細(xì)胞（%）Tr細(xì)胞/ CD4+T細(xì)胞IL-18（pg/ml）急性ITP組（n=42）3.11±0.83*27.36±5.11*0.11±0.02*436.05±95.90△對照組（n=42）5.52±0.8337.18±5.480.15±0.03162.82±57.61

2.2 急性ITP組與對照組外周血Foxp3+Tr細(xì)胞表達(dá)水平比較 急性ITP患兒外周血Foxp3+Tr細(xì)胞與Tr細(xì)胞的比值為（0.42±0.12），對照組外周血Foxp3+Tr細(xì)胞與Tr細(xì)胞的比值為（0.75±0.17），兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 急性ITP患兒外周血Tr細(xì)胞表達(dá)與血清IL-18水平的相關(guān)性分析 將Tr細(xì)胞表達(dá)與血清IL-18水平進(jìn)行相關(guān)性分析，如圖1所示，急性ITP組血清IL-18水平越高，外周血Tr細(xì)胞表達(dá)水平均越低，二者呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.821，P<0.01）。

圖1 外周血Tr細(xì)胞表達(dá)與血清IL-18水平的相關(guān)趨勢圖

3 討論

ITP以患者體內(nèi)抗血小板抗體增多，血小板破壞過多而出血為特點，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，可能涉及T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨核細(xì)胞、細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子等多因素錯綜復(fù)雜的關(guān)系，尤其是T細(xì)胞免疫在巨核細(xì)胞受抑和血小板破壞中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用[4]。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是近年來發(fā)現(xiàn)的存在于正常人外周血和脾臟中一類特定亞群的CD4+T細(xì)胞，正常人外周血淋巴細(xì)胞中約占5%~10%，具有免疫無能性和免疫抑制性兩大特性的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群，介導(dǎo)的抑制作用非常復(fù)雜，主要通過直接細(xì)胞接觸途徑、分泌抑制性細(xì)胞因子途徑、間接抑制途徑、細(xì)胞溶解途徑、競爭性抑制途徑這五大途徑發(fā)揮抑制功能，能抑制自身反應(yīng)性T、B細(xì)胞的活化和增殖及自身抗體的產(chǎn)生[5]。由于ITP患者存在自身反應(yīng)性T細(xì)胞的異?；罨?，活化的CD4+T效應(yīng)細(xì)胞表面也表達(dá)CD25分子，很難區(qū)分這兩群功能不相同的細(xì)胞，因此，CD4+CD25+T細(xì)胞數(shù)量并不能代表真正的調(diào)節(jié)細(xì)胞水平[6]。Foxp3表面分子是脊椎動物叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子的總稱，特異性表達(dá)在CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞上，是CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的一個特異性標(biāo)志。Foxp3表達(dá)在CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的發(fā)育和功能上起重要作用。Walker等[7]研究表明，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞細(xì)胞的活化可導(dǎo)致CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)Foxp3增加，并與抑制活性有關(guān)。呂學(xué)文等[7]研究發(fā)現(xiàn)，ITP者外周血Tr數(shù)量減少，F(xiàn)oxp3 mRNA表達(dá)也減少，提示Foxp3可能通過翻譯水平的改變調(diào)節(jié)Tr細(xì)胞抑制功能。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞主要通過細(xì)胞-細(xì)胞直接接觸作用和細(xì)胞因子發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。IL-18是1996年正式命名的細(xì)胞因子，主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是一種強(qiáng)有力的免疫調(diào)節(jié)因子，其結(jié)構(gòu)與IL-1相似，功能與IL-12相似，但發(fā)揮作用卻不依賴于兩者。IL-18作為細(xì)胞炎性介質(zhì)的誘導(dǎo)者，通過與其受體結(jié)合，不僅可誘導(dǎo)IL-2及TNF-α等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，促進(jìn)Th1類細(xì)胞的增殖、發(fā)育和分化，產(chǎn)生Th1型免疫應(yīng)答，而且可通過增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，直接誘導(dǎo)NK細(xì)胞或T細(xì)胞產(chǎn)生INF-γ，從而誘發(fā)嚴(yán)重的免疫紊亂。故深入研究IL-18在ITP患者中表達(dá)水平的變化，在用于探討ITP發(fā)病機(jī)制及指導(dǎo)其治療中有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，ITP患兒外周血Tr細(xì)胞的數(shù)量及CD4+T細(xì)胞中Tr細(xì)胞的比例均明顯低于正常對照組（P<0.05），與芮耀耀等[9]研究結(jié)果相符。表明ITP息兒外周血中Tr細(xì)胞數(shù)量減少，由此可能導(dǎo)致機(jī)體自身有效的免疫抑制功能的減弱，使Thl/Th2平衡向Thl偏移，導(dǎo)致Tr細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步減少，自身反應(yīng)性T細(xì)胞激活增多、凋亡減少，同時促進(jìn)自身反應(yīng)性B細(xì)胞增殖，導(dǎo)致B細(xì)胞產(chǎn)生抗血小板抗體增多，從而促進(jìn)了血小板破壞增加。急性ITP患兒外周血Foxp3+Tr細(xì)胞與Tr細(xì)胞的比值較對照組顯著降低（P<0.05），提示缺乏Foxp 3的功能性表達(dá)可能導(dǎo)致本應(yīng)發(fā)育為Treg的胸腺T細(xì)胞分化為自身反應(yīng)性T細(xì)胞，并逃避陰性選擇，攻擊自身抗原而致自身免疫病，此可能為導(dǎo)致ITP發(fā)病的原因之一[10]。同時筆者的結(jié)果也表明，與正常對照組相比，急性ITP患兒患兒外周血血清IL-18水平明顯升高（P<0.01），與王謙等[11]研究相符。相關(guān)性分析結(jié)果表明，IL-18含量與CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)之間呈顯著負(fù)相關(guān)，IL-18含量越高，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)越少，表明血清IL18在ITP發(fā)病機(jī)制上有著重要的作用。IL-18的生物學(xué)功能是通過與淋巴細(xì)胞表面的IL-18受體（IL-18R）的相互作用實現(xiàn)的。表明IL-18通過上調(diào)IL-18R的表達(dá)共同參與了ITP患者Thl型反應(yīng)優(yōu)勢中的病理過程，IL-18與IL-18R結(jié)合后，通過IL-1受體相關(guān)激酶途徑誘導(dǎo)NF-kB的活化，促進(jìn)INF-γ等Th1細(xì)胞相關(guān)因子的釋放，從而加重Thl/Th2細(xì)胞的失衡，IL-18及IL-18R導(dǎo)致Thl細(xì)胞的優(yōu)勢應(yīng)答，可能是ITP發(fā)生的機(jī)制之一[12]。因此，筆者推測可能由于急性ITP患兒外周血中Tr細(xì)胞數(shù)量的減少可能刺激外周血淋巴細(xì)胞IL-18的生成，加劇了Th1/Th2細(xì)胞之間的失衡，導(dǎo)致Tr細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步減少，有效的免疫抑制作用降低，自身反應(yīng)性T細(xì)胞激活增多、凋亡減少，促進(jìn)了血小板的破壞。

總之，急性ITP患兒外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性性T細(xì)胞數(shù)量減少和II-18水平升高可能在AITP發(fā)病中起重要作用，兩者共同通過加劇Thl/Th2失衡，機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)功能異常從而導(dǎo)致ITP的發(fā)生。

[1] Semple J W，Provan D，Garvey M B，et al. Recent progress in understanding the pathogenesis of immune thrombocytopenia[J].Curr Opin Hematol，2010，17（6）：590-595.

[2] Park S H，Kim J Y，Kim S K，et al.Regulatory T-cells in systemic lupus erythemat-osus associated thrombocytopenia: a comparison with idiopathic thrombocytopenic purpura[J].Lupus，2010，19（7）：888-889.

[3] 張之南.血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)[M].第2版.北京：科學(xué)出版社，1998:279-281.

[4] Nosotti M，F(xiàn)alleni M，Palleschi A，et al. Reaction detection of lymph node lung cancer micrometastasis using carcinoembryonic antigen marker[J].Chest，2005，128（3）：1539-1544.

[5] 凌云，曹祥山，余自強(qiáng)，等.CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在特發(fā)性血小板減少性紫癜患者中的變化[J].中華血液學(xué)雜志，2007，28（3）：184-188.

[6] Sakaguchi S，Sakaguchi N，Shimizu J，et al.Immunologic tolerance maintained by CD4+CD25+regulatory T cells: their common role in controlling autoimmunity，tumor immunity，and transplantation tolerance[J].Immunol Rev，2001，182（1）：18-32.

[7] Walker M R，Kasprowicz D J，Gersuk V H，et al.Induction of FoxP3 and acquisition of T regulatory activity by stimulated human CD4+CD25-T cells[J].J Clin Invest，2003，112（9）：1437-1443.

[8] 呂學(xué)文，劉仿，伍昌林，等.急性ITP患兒外周血CD4+CD25+T細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子的研究[J].臨床檢驗雜志，2007，25（2）：104-106.

[9] 芮耀耀，張?zhí)m芳，錢小青，等.兒童特發(fā)性血小板減少性紫癜患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平的檢測及其意義[J].江蘇大學(xué)學(xué)報，2007，17（4）：340-343.

[10] 常大雨，周榮富，歐陽建.特發(fā)性血小板減少性紫癜的發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展[J].血栓與止血學(xué)，2009，15（1）：36-39.

[11] 王謙，楊曉靜，單寧寧，等.IL-18及其受體在特發(fā)性血小板減少性紫癜患者Thl類細(xì)胞優(yōu)勢應(yīng)答中的作用[J].中華血液學(xué)雜志，2009，30（10）：658-661.

[12] Schindler H，Lutz M B.The production of IFN-gamma by IL-12/IL-18 activated macrophages requires STAT4 signaling and is inhibited by IL-4[J].J Immunol，2001，166（5）：3075-3082.