梔子苷對(duì)阿爾茨海默病模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

陳安春，任杰，張培哲，李世朋，施志杰，陳新新

梔子苷(Geniposide)是梔子中的主要活性成分，具有利膽、抗炎、鎮(zhèn)痛等作用[1]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)梔子苷能促進(jìn)神經(jīng)軸突再生，增加細(xì)胞對(duì)擬膽堿藥物的敏感性和增加細(xì)胞膜的去極化，抑制顱內(nèi)非感染性炎性病變[2]。同時(shí)梔子苷可以抑制局灶性腦缺血損傷引起的神經(jīng)元凋亡[3]。但關(guān)于梔子苷對(duì)行為和認(rèn)知影響的相關(guān)報(bào)道少見(jiàn)，本文利用AlCl3建立阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)大鼠模型，探討梔子苷對(duì)AD模型大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)用品與試劑Morris水迷宮儀(成都泰盟軟件有限公司)，萊佧織切片機(jī)(德國(guó)萊佧公司)，梔子苷(西安昊軒生物科技有限責(zé)任公司)，氯化鋁結(jié)晶(天津市大茂化工試劑廠)，其他試劑為市售分析純。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量250～320 g。所有大鼠飼養(yǎng)條件一致，籠養(yǎng)，喂以大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由攝食、攝水。

1.3動(dòng)物造模與給藥采用錢亦華等的方法[4]誘導(dǎo)建立AD模型和判斷AD模型建立成功與否，記錄10 min內(nèi)大鼠受電擊次數(shù)及每次潛伏期。10 min內(nèi)電擊次數(shù)大于對(duì)照值2倍，平均潛伏期小于對(duì)照值20%者為成功AD模型。32只SD大鼠AD模型建立成功，然后隨機(jī)分為4組，每組8只，分別為正常組、模型組、梔子苷高劑量組、梔子苷低劑量組。梔子苷高劑量組按90 mg/kg進(jìn)行腹腔注射，梔子苷低劑量組按40 mg/kg進(jìn)行腹腔注射，模型組注射0.5 mL無(wú)菌生理鹽水。按此方法連續(xù)給藥70 d，待模型建立成功后對(duì)大鼠進(jìn)行Morris水迷宮行為學(xué)檢測(cè)。

1.4Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)水池內(nèi)事先放入奶粉，平臺(tái)放置水下2～2.5 cm，實(shí)驗(yàn)時(shí)把大鼠每次隨機(jī)面朝池壁放入水池中，令大鼠在水池內(nèi)游泳直到找到平臺(tái)為止，60 s后未找到平臺(tái)者，將其引至平臺(tái)。每只大鼠每天訓(xùn)練4次，每次間隔2 h，連續(xù)訓(xùn)練5 d，以訓(xùn)練大鼠的學(xué)習(xí)能力。第6天撤除平臺(tái)，任選一個(gè)入水點(diǎn)將大鼠放入水中，測(cè)量60 s內(nèi)大鼠穿越原平臺(tái)位置次數(shù)，并記錄潛伏期，超過(guò)60 s，潛伏期即60 s，以反映反映大鼠的記憶能力。

1.5病理學(xué)檢測(cè)行為學(xué)測(cè)試完畢后，木板上固定大鼠，經(jīng)10%水合氯醛腹腔麻醉。用4%多聚甲醛灌注升主動(dòng)脈以固定腦組織，并取出包含腦組織，置于4%多聚甲醛固定液中固定約24 h，流水沖洗2 h。常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋。厚度為4 μm連續(xù)切片，貼于載玻片上。最后進(jìn)行HE染色。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠定位航行試驗(yàn)逃避潛伏期的變化各組大鼠定位航行試驗(yàn)結(jié)果由表1可知，連續(xù) 5 d隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加，各組大鼠逃避潛伏期逐漸縮短，但模型組大鼠逃避潛伏期降低得很少，1～5 d模型組大鼠逃避潛伏期均明顯大于其他各組，模型組大鼠與其他組有顯著性差異(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)間的水迷宮潛伏期比較 s

與空白組相比：①P<0.05，②P<0.01；與模型組相比：③P<0.05，④P<0.01

2.2撤平臺(tái)后大鼠60s在各個(gè)象限內(nèi)的穿越次數(shù)分布情況由表2可知，模型組大鼠穿越平臺(tái)及有效區(qū)的次數(shù)少于正常組、給藥組，與正常組及給藥組比較有顯著性差異(P<0.05)。模型組在平臺(tái)區(qū)游泳時(shí)間及有效區(qū)的游泳時(shí)間均少于正常組、給藥組，與正常組比較差異顯著(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 撤平臺(tái)后大鼠空間搜索實(shí)驗(yàn)情況 s

與空白組相比：①P<0.05，②P<0.01；與模型組相比：③P<0.05，④P<0.01

2.3HE染色結(jié)果高倍鏡下給藥組、正常組海馬區(qū)細(xì)胞均以淡染為主，濃染細(xì)胞較少，核仁清楚可見(jiàn)，而模型組大鼠海馬區(qū)細(xì)胞核碎裂，核溶解，細(xì)胞以濃染為主，核胞漿不清楚，核仁未見(jiàn)。表明模型組大鼠細(xì)胞異于其他各組，而給藥組細(xì)胞與正常組、對(duì)照組相比，都是以淡染細(xì)胞為主，濃染細(xì)胞數(shù)量極少。見(jiàn)圖1。

A：空白組(HE，400×) B：模型組(HE，400×)

3 討論

阿爾茨海默病是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以高級(jí)認(rèn)知功能障礙為特征，病理特征以老年斑、神經(jīng)纖維纏結(jié)和神經(jīng)元丟失為主。老年斑的核心成分是β淀粉樣蛋白(Aβ)。近年研究發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)鋁的含量明顯超過(guò)正常值時(shí)鋁對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有毒性損害，使神經(jīng)元變性或死亡，繼而大腦皮質(zhì)萎縮，腦重減輕，出現(xiàn)記憶、認(rèn)知功能障礙。鋁可以引起β淀粉樣肽在腦內(nèi)沉積和β淀粉樣前體蛋白在神經(jīng)元的過(guò)度表達(dá)[4-5]。鋁在海馬富集程度增加，導(dǎo)致大鼠運(yùn)動(dòng)行為能力和短期記憶能力下降[6]。

梔子苷是梔子中含有的一種環(huán)烯醚萜苷類化合物，具有多種藥理活性，如降血糖、抗炎、抗腫瘤、神經(jīng)退行性疾病等作用。研究表明梔子苷對(duì)PCl2(來(lái)源大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤)細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用中梔子苷誘導(dǎo)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，Bcl-2可抑制由過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的凋亡[7]。丁嵩濤[8]等發(fā)現(xiàn)梔子苷可以增加細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)NOS活性，促進(jìn)NO生成恢復(fù)正常水平，明顯減少細(xì)胞內(nèi)活性氧簇的形成。同時(shí)梔子甙可以改善血管性癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，提高慢性全腦低灌注大鼠的遠(yuǎn)期生存率，減輕低灌注所致神經(jīng)元凋亡壞死[9]。

本實(shí)驗(yàn)用A1Cl3建立阿爾茨海默病大鼠模型，探討梔子苷對(duì)AD模型大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的影響。結(jié)果可見(jiàn)，梔子苷處理后的AD大鼠學(xué)習(xí)和記憶行為得到明顯的改善，尤其是高劑量處理后，可以明顯縮短游出迷宮時(shí)間和減少大鼠定位航行試驗(yàn)潛伏期；同時(shí)梔子苷明顯增加AD大鼠的探究行為。這些作用提示梔子苷長(zhǎng)期應(yīng)用對(duì)AD病人的學(xué)習(xí)記憶障礙有改善作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]方尚玲,劉源才,張慶華,等.梔子苷鎮(zhèn)痛和抗炎作用的研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2008,19(6):1374-1376．

[2]鄧世山,付莉.熊若虹,等.梔子提取物(環(huán)烯醚萜總甙)對(duì)大鼠尾狀核腦出血病理指標(biāo)的影響[J].華西醫(yī)學(xué),2005,20(2):293-294．

[3]辛海濤,王衛(wèi)寧.梔子苷對(duì)大鼠局灶性腦缺血模型缺血腦組織HIF-1α蛋白和RTP801的影響[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2010，16(36)：25-26.

[4]錢亦華,楊杰,任惠民,等．癡呆模型大鼠背海馬結(jié)構(gòu)內(nèi)淀粉樣蛋白沉積的免疫細(xì)胞化學(xué)研究[J].西安醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1997，18(30)：304-305.

[5]胡海濤,錢亦華,楊杰,等．淀粉樣前體蛋白在癡呆模型大鼠背海馬結(jié)構(gòu)的表達(dá)[J].解剖學(xué)雜志，1997，20(5)：444.

[6] 賈宜昌,鐘才云,王穎明,等．鋁對(duì)大鼠海馬氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)舍量的影響[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2001，30(6)：397-400.

[7]LIU Jian-hui,YlN Fei，GUO Li-xia．Neuroprotection of geniposide against hydrogen peroxide induced PC12 cells injury：involvement of Pl3 kinase signal pathway[J]．Acta Pharmacol Sin，2009,30(2)：159-165．

[8]丁嵩濤,劉洪濤,李文明,等.梔子苷對(duì)氧化應(yīng)激損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用[J]．中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2009，25(6)：725-729．

[9]李利娟,李宏霞,吳欣桐,等.梔子甙對(duì)血管性癡呆大鼠行為學(xué)和腦組織病理改變的影響[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2009,40(4):605-607.