HPLC 法測(cè)定黃芩不同部位中黃芩苷和野黃芩苷的含量

★ 李曉芳 吳榮 葉喜德 (. 江西省中醫(yī)院 南昌330006;. 江西省余干縣人民醫(yī)院 余干33500;3.江西中醫(yī)學(xué)院 南昌330004;4.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 廣州50006)

黃芩(Scutelalria baicalensis Georgi)來(lái)源于唇形科植物黃芩的干燥根，為多年生草本，主根粗壯，莖高約30 －120 cm，自基部多分枝。黃芩又被稱(chēng)為黃金茶、山茶根或者爛心草，是臨床上十分常用的中藥，具有良好的瀉火解毒、止血涼血、安胎除熱的作用?，F(xiàn)代研究表明，黃芩富含黃酮類(lèi)化學(xué)成分，其中主要是黃芩苷(baicalin)，黃芩甙藥理作用廣泛，臨床主要用于抗菌、消炎和抗感染［1，7］等。而其莖葉為黃芩藥材的地上部分，主要含有野黃芩苷(scutellarin)，該成分具有清熱解毒，擴(kuò)張心腦血管，改善體內(nèi)微循環(huán)等作用［2］。為了黃芩資源的合理利用和生藥(或制劑)的質(zhì)量控制，我們建立了黃芩苷和野黃芩苷的HPLC 分析方法，對(duì)黃芩不同部位的主要成分黃芩苷和野黃芩苷的含量進(jìn)行了測(cè)定。

1 材料

HPLC 儀器:LC －20AT 高效液相色譜儀(島津公司，日本)，包括SPD－M20A 二極管陣列檢測(cè)器，SIL－20A 自動(dòng)進(jìn)樣器，LC －solution 液相色譜工作站。其它儀器:電子分析天平FA2004，上海天平儀器廠;TDL－5 －A 型低速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;QN －99 粉碎機(jī)，韓國(guó)日進(jìn)精工有限公司;8002 型恒溫水浴控制器，余姚明偉儀表廠。

甲醇、乙腈為色譜純，乙醇、醋酸、磷酸為分析純，水為自制重蒸水。黃芩苷對(duì)照品，購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所(批號(hào):110715 －201016);野黃芩苷對(duì)照品，購(gòu)于北京亞希爾科技有限公司。黃芩根、莖、葉均采購(gòu)于市場(chǎng)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 黃芩苷檢測(cè)參考藥典方法，并稍作改動(dòng):色譜柱為T(mén)exra C18 柱(4.6 mm × 200 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇－水(53∶47)，水用磷酸調(diào)pH值約為3(磷酸∶水=2∶500，V/V)，流速為0.9 mL/分，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量20 μL。

野黃芩苷檢測(cè):色譜柱同黃芩苷檢測(cè)，流動(dòng)相以甲醇－0.2%醋酸溶液進(jìn)行梯度洗脫，0 －30 分鐘甲醇由40%增加到70%;洗脫流速為0.9 mL/分，檢測(cè)波長(zhǎng)334 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液制備 黃芩苷:精密稱(chēng)取在60℃干燥恒重的黃芩苷對(duì)照品6.00 mg，加甲醇定容至100 mL 的容量瓶，配成60 μg/mL 濃度的對(duì)照品溶液，用時(shí)稀釋至60、24、12、6、3 μg/mL 共5 個(gè)濃度梯度。

野黃芩苷:精密稱(chēng)取在P2O5干燥器中干燥24小時(shí)的野黃芩苷對(duì)照品10.00 mg，加甲醇定容至25 mL 的容量瓶，配成0.4 mg/mL 濃度的對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液制備 黃芩苷提取［3］:分別精密稱(chēng)取樣品粉末(過(guò)60 目篩)1.00 g，加70%乙醇100 mL，回流提取4 小時(shí)，提取液過(guò)濾，除去殘?jiān)ㄈ葜?00 mL 容量瓶中，即得供試樣品。

黃芩苷提?。?］:稱(chēng)取樣品粉末(過(guò)60 目篩)1.00 g，精密稱(chēng)定，置索氏提取器中用石油醚(60 －90)洗脫至無(wú)色，取出，晾干，在索氏提取器中用80 mL甲醇連續(xù)洗脫至無(wú)色，使野黃芩苷提取完全，放冷，濾過(guò)，濾液置100 mL 容量瓶中，用少量甲醇分?jǐn)?shù)次洗滌容器，洗液濾入同一容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 黃芩苷對(duì)照品溶液進(jìn)樣20 μL，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，對(duì)照品色譜圖見(jiàn)圖1(a)。以峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，黃芩苷濃度(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y = 0.73×105X －1.5 ×105(r =0.999 8)。結(jié)果表明，進(jìn)樣體積20μL，檢測(cè)波長(zhǎng)λ280 nm，黃芩苷在1.5 －60 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好［4］。

取濃度為0.400 mg/mL 的野黃芩苷對(duì)照品溶液5、10、15、20、25 μL 依次進(jìn)樣，在本文2.1 色譜條件下，測(cè)定色譜峰面積，對(duì)照品色譜圖見(jiàn)圖1(b)。以對(duì)照品質(zhì)量x (μg)為橫坐標(biāo)，峰面積Y 為縱坐標(biāo)，回歸得直線方程為Y =1.36 ×106X －2.07 ×106(r=0.999 5)。

圖1 對(duì)照品色譜圖

2.5 精密度試驗(yàn) 取2.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液黃芩苷(6 μg/mL)20 μL 和野黃芩苷(0.4 mg/mL)10 μL，分別連續(xù)進(jìn)樣5 次，結(jié)果黃芩苷的平均峰面積為225601 (RSD =0.35%);野黃芩苷的平均峰面積為3043702 (RSD=0.57%)。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.3 項(xiàng)下樣品溶液，室溫放置0、4、8、12、16、20、24 小時(shí)后測(cè)定，結(jié)果測(cè)得的黃芩苷和野黃芩苷面積基本不變，RSD 分別為0.59%、0.82%，表明樣品溶液在24 小時(shí)之內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗(yàn) 取已知黃芩苷和野黃芩苷的黃芩莖部樣品100.0 mg 共5 份，各精密加入黃芩苷對(duì)照品10.05 mg、野黃芩苷對(duì)照品8.05 mg，按樣品溶液制備方法制備，依上述方法測(cè)定，結(jié)果黃芩苷、野黃芩苷平均回收率分別為100.04%(RSD=0.75%)和99.26%(RSD=1.21%)。

2.8 樣品測(cè)定 按2.3 項(xiàng)，黃芩根、莖、葉配制樣品溶液各3 份［5］，依法測(cè)定，黃芩苷、野黃芩苷含量及色譜峰出峰時(shí)間。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 樣品測(cè)定結(jié)果(含量%，n=3)

3 討論

中藥黃芩的藥用部位為植物黃芩的根，根據(jù)HPLC 分析的結(jié)果，黃芩根中黃芩苷的含量較高，因此可能是黃芩的主要活性成分。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的結(jié)果符合2010 年版藥典中規(guī)定黃芩苷含量不得少于9.0%的標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)際含量為10.872%，說(shuō)明市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的黃芩藥材質(zhì)量尚可［6］。與文獻(xiàn)［2］中黃芩莖、葉所含的野黃芩苷相比(0.641%)，本文所購(gòu)莖、葉材料中含量更高(分別為2.257%和3.316%)，這可能與產(chǎn)地有關(guān)系，不同產(chǎn)地的黃芪藥材中有效成分存在一定的差異［3］。另外，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，黃芩根、莖和葉不同的藥理作用在化學(xué)成分的差異上得到了體現(xiàn)。黃芩莖、葉中黃芩苷的含量較低，主要成分為野黃芩苷，因此莖、葉部位雖然亦可藥用，但不可代替黃芩藥材。

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