CDNF治療大鼠脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究

張 輝 婁永利 閔有會(huì) 姜 羽

鄭州大學(xué)附屬鄭州市中心醫(yī)院神經(jīng)外科，河南鄭州 450007

脊髓損傷的特點(diǎn)就是致殘率、耗費(fèi)較高，但是對(duì)于其治療方法仍然沒有確切的結(jié)論，給社會(huì)帶來重大的負(fù)擔(dān)。目前，隨著神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)分子（即CDNF）研究的深入，脊髓損傷治療也出現(xiàn)了新的轉(zhuǎn)機(jī)。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)分子具有調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)與發(fā)育的功效，是一種促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)的小分子蛋白。該文選擇了75 至雌性大鼠，研究CDNF 對(duì)于大鼠脊髓損傷的治療效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇健康的Wista 雌性大鼠75只，其平均體重為268.49g，將上述大鼠隨機(jī)分為3組。將其中25只設(shè)置為假手術(shù)組（A組），25只設(shè)定為單純脊椎損傷組（B組），25只設(shè)定為采用CDNF 治療脊髓損傷組（C組）。A組大鼠不損傷其脊髓，僅進(jìn)行脊髓半切損傷模型。B組大鼠注入生理鹽水。對(duì)C組大鼠注入10?LCDNF。

1.2 脊髓半切損傷動(dòng)物模型

稱取上述大鼠的具體重量，使用30 mg/kg 的水合氯醛進(jìn)行腹腔注射麻醉。靜待大鼠至全麻狀態(tài)，使其使大鼠俯臥在手術(shù)臺(tái)上，并對(duì)其四肢進(jìn)行捆綁固定，剪除手術(shù)區(qū)的毛發(fā)。確定第10 胸椎的位置，對(duì)皮膚進(jìn)行消毒后鋪設(shè)一次性手術(shù)巾。將大鼠的背部皮膚以及皮下組織切開，使其T8～11處的棘突和椎板更充分的暴露出來。采用持針器把棘突和關(guān)節(jié)突進(jìn)行摘除，使脊髓節(jié)段暴露更充分。對(duì)胸髓一側(cè)采取橫向剖開，并把硬模直至中央導(dǎo)水管切斷，使用衛(wèi)星注射器，對(duì)大鼠的脊髓進(jìn)行2 mm 缺損傷害。在手術(shù)后，大鼠的一側(cè)肢體會(huì)出現(xiàn)痙攣性抽搐并出現(xiàn)癱瘓癥狀，這說明脊髓的版企鵝損傷模型已經(jīng)制作成功，隨后可以對(duì)大鼠進(jìn)行止血、縫合皮膚等操作。

1.3 術(shù)后管理

在手術(shù)后使用清潔籠具對(duì)大鼠進(jìn)行單獨(dú)喂養(yǎng)，進(jìn)行青霉素注射，預(yù)防大鼠出現(xiàn)感染。同時(shí)每天擠壓大鼠的腹部，幫助其進(jìn)行排便直至膀胱功能恢復(fù)。此外，還要定時(shí)對(duì)大鼠進(jìn)行翻身，防止其出現(xiàn)褥瘡。在手術(shù)后不同時(shí)間段內(nèi)對(duì)大鼠進(jìn)行應(yīng)用行為學(xué)評(píng)分。

1.4 免疫組織化學(xué)染色與電鏡標(biāo)本制作

在手術(shù)結(jié)束后14 d時(shí)，對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔的麻醉，將其胸部解剖開后以左心房為入口進(jìn)行置管，若果其右心房有午夜透明液體流出，則即刻使用10%的中性福爾馬林溶液對(duì)大鼠進(jìn)行關(guān)注固定。關(guān)注30 min后，顯露手術(shù)階段，取出2 cm 左右的損傷脊髓，標(biāo)記后置入10%甲醛溶液進(jìn)行固定。

在手術(shù)后8周，將動(dòng)物進(jìn)行腹腔麻醉，剖開胸部后以生理鹽水進(jìn)行灌注。生理鹽水灌注200 mL后采用40/L 的戊二醛溶液繼續(xù)灌注。固定2 h后，取出損傷節(jié)段的脊髓組織，固定24 h后，使用環(huán)氧樹脂進(jìn)行包埋后制作超薄切片，電鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS17.0 對(duì)收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，進(jìn)行t 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠的應(yīng)用行為學(xué)評(píng)分

對(duì)手術(shù)后的大鼠進(jìn)行應(yīng)用行為學(xué)評(píng)分，發(fā)現(xiàn)A組大鼠的評(píng)分為滿分，在進(jìn)行脊髓半切損傷之后大鼠的一側(cè)后肢則喪失了運(yùn)動(dòng)功能。在手術(shù)后1周，B組大鼠也出現(xiàn)側(cè)后肢的攣縮，C組患者沒有出現(xiàn)后肢攣縮。在手術(shù)后2～4 周時(shí)，B組大鼠和C組大鼠均出現(xiàn)不同程度的恢復(fù)。在手術(shù)后4～8周后，恢復(fù)的幅度變小。手術(shù)2周后B組和C組大鼠的應(yīng)用學(xué)評(píng)分出現(xiàn)明顯差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 大鼠的應(yīng)用行為學(xué)評(píng)分

2.2 3組大鼠的GFAP表達(dá)情況

對(duì)免疫組織進(jìn)行化學(xué)染色觀察，A組大鼠中GFAP 也出現(xiàn)了GFAP 陽性細(xì)胞表達(dá)。在脊髓損傷的大鼠脊髓細(xì)胞標(biāo)本中，能夠發(fā)現(xiàn)GFAP的表達(dá)無規(guī)律且明顯增多。C組大鼠的GFAP 陽性細(xì)胞低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 3組大鼠的GFAP表達(dá)情況對(duì)比

2.3 電鏡下脊髓損傷的病理變化

在電鏡觀察下，B組大鼠的神經(jīng)元細(xì)胞核出現(xiàn)碎裂，在脊髓神經(jīng)纖維髓鞘斷裂分層的部位沒有出現(xiàn)新生的軸突。B組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞核也出現(xiàn)碎裂，髓鞘斷裂分層，僅有少量的再生軸突，其細(xì)胞質(zhì)中線粒體數(shù)量含量較少。

3 討論

脊髓損傷一般分為2個(gè)階段，即原發(fā)性和繼發(fā)性。脊髓損傷之后，會(huì)出現(xiàn)出血性壞死、水腫、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞等。在脊髓損傷出現(xiàn)的早期，血管就會(huì)出現(xiàn)破壞，脊髓的灰質(zhì)內(nèi)的一部分神經(jīng)元、白質(zhì)內(nèi)部的少突出膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)壞死。這些壞死的細(xì)胞就會(huì)釋放出大量的自由基，這些自由基會(huì)氧化鄰近的細(xì)胞，損傷細(xì)胞膜，破壞細(xì)胞內(nèi)的重要結(jié)構(gòu)。在脊髓損傷的過程中，還會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的炎性反應(yīng)。因此而激活損傷處的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，該類細(xì)胞可吞噬脊髓損傷區(qū)壞死的細(xì)胞以及碎片。這個(gè)過程炎性反應(yīng)可造成脊髓組織缺血，致使脊髓組織發(fā)生壞死，使細(xì)胞壞死范圍擴(kuò)大。

該研究證明，C組大鼠的應(yīng)用行為學(xué)評(píng)分明顯高于B組，但是仍然低于A組。C組的GFAP的表達(dá)低于B組。C組大鼠的GFAP 陽性細(xì)胞低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。CDNF 對(duì)于脊髓損傷后反應(yīng)性星形膠質(zhì)瘢痕性的形成有明顯的抑制作用，進(jìn)而能夠促進(jìn)突觸的連接重建，加速神經(jīng)功能的恢復(fù)。CDNF對(duì)于治療脊髓損傷的原理在于，抑制脊髓損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和活性，遏制瘢痕的出現(xiàn)，重建神經(jīng)元的突觸連接。但是，該次試驗(yàn)也證明，CDNF 治療脊髓損傷的功效仍然有其局限性，若將這一技術(shù)與干細(xì)胞技術(shù)相結(jié)合，為脊髓損傷的治療提供更多的參考資料，方可更好的治療脊髓損傷，提高患者的生活質(zhì)量。

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