長期儲藏干燥發(fā)菜超微結(jié)構(gòu)和生理特性分析

張亞萍，雷曉婷，楊 佳，林 佳，周有文，梁文裕

(寧夏大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，寧夏 銀川750021)

發(fā)菜(Nostoc flagelliforme)是一種陸生固氮藍(lán)藻，主要分布于干旱-半干旱荒漠草原地區(qū)，是當(dāng)?shù)刂匾墓痰Y源和防風(fēng)固沙的先鋒植物［1-2］。發(fā)菜的結(jié)構(gòu)和生理表現(xiàn)出很強(qiáng)的旱生生態(tài)適應(yīng)性，能在極度干燥的條件下存活數(shù)十年，復(fù)吸水后仍可迅速恢復(fù)代謝活性［3］。目前有關(guān)發(fā)菜的研究主要集中在生長發(fā)育［4］、生理生態(tài)［5-6］及對極端環(huán)境的適應(yīng)領(lǐng)域［2，7-8］，而對于發(fā)菜能耐儲藏及可長期保持生理活性的機(jī)理知之甚少。因此，以野生干燥發(fā)菜為對照，對儲藏十年干燥發(fā)菜的超微結(jié)構(gòu)及生理代謝進(jìn)行研究，以期為探討發(fā)菜耐長期儲存的適應(yīng)和保護(hù)機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

長期儲藏干燥發(fā)菜(LTS)和野生干燥發(fā)菜(NGS)均采自寧夏香山同一發(fā)菜自然生長地。長期儲藏干燥發(fā)菜在實驗室陰涼干燥避光儲藏10年，發(fā)菜含水量14.1%。野生干燥發(fā)菜為野外正常生長狀態(tài)的干燥發(fā)菜，采集條件為25℃、光照強(qiáng)度200 μmoL·m-2·s-1、空氣相對濕度 35%、光周期 14 h/10 h，發(fā)菜含水量 7.1%。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)菜超微結(jié)構(gòu)觀察

發(fā)菜超薄切片的制備參照董渭祥等的方法［9］并做適當(dāng)修改。將處理好的發(fā)菜樣品切成1 mm×2 mm的小段，放入干凈小瓶，2.5%戊二醛前固定3 h，PBS 緩沖液(pH 7.2)沖洗3 次，每次15 min;然后1.0%四氧化鋨后固定4 h，再用PBS緩沖液洗滌3次，每次15 min;系列濃度梯度丙酮脫水，每次30 min;不完全樹脂滲透，Epon812樹脂包埋，KB 2088超薄切片機(jī)切片，厚度700～800 nm;醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛雙重染色。加速電壓為80 kV，H-7650B透射電鏡觀察拍照。

1.2.2 光合活性的檢測

光合活性的檢測采用Zhao等方法［10］。凈光合活性根據(jù)下列公式計算:

其中C/t記錄的CO2濃度負(fù)斜率，V是密閉體系的體積(0.579 L)，T是同化室溫度，Wf樣品干重。

暗呼吸采用 Krause和 Weis［3］的方法。

1.2.3 光合色素含量測定

葉綠素含量測定參照Mackinney等人方法［11］。稱取1 g樣品，加入15 mL無水甲醇過夜提取4℃，經(jīng)5 000 r·min-1離心5 min，測定其吸光值。按公式計算

葉綠素 a含量:C a=(μg·mL-1)=16.29·A665-8.54·A652

類胡蘿卜素含量:C(μg·mL-1)=7.6(A480-1.49·A510)

藻膽素含量測定采用張薇君［12］等人的方法。準(zhǔn)確稱取1 g發(fā)菜樣品，用pH 7.0緩沖液，定溶于25 mL容量瓶中;置于-20℃冰箱內(nèi)冷凍12 h，取出解凍后，3 000 r·min-1離心15 min，取上層清液，用提取液做空白，分別測定620 nm，652 nm，562 nm處的吸光度(整個操作過程要求避光)。

1.2.4 脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖含量測定

脯氨酸含量測定參照Hyman等人［13］方法。稱取1 g發(fā)菜樣品，用3%的磺基水楊酸溶液研磨，磺基水楊酸的最終體積為10 mL。勻漿液轉(zhuǎn)入試管中，有塑料薄膜封口，在沸水浴中浸提30 min，冷卻后，以3 000 r·min-1離心10 min，取上清液待測。取2 mL上清液，加2 mL水，同標(biāo)準(zhǔn)曲線程序進(jìn)行顯色、萃取和比色。脯氨酸(μg·g-1)=C·Vt/(W·Vs)，其中C:標(biāo)線查的脯氨酸含量;Vt提取液總體積;Vs:測定用體積;W:樣品干重。

蛋白質(zhì)含量的測定參考Bradford的方法［14］。

可溶性糖含量測定參照Kuo等人［15］的方法。

1.2.5 丙二醛、超氧陰離子自由基和過氧化氫含量測定

丙二醛含量測定參照王跟軒等［16］人方法并做適當(dāng)修改。稱取1 g發(fā)菜樣品，加入2 mL 10%三氯乙酸(TCA)和少許石英砂研磨，進(jìn)一步加入8 mL 10%TCA充分研磨，勻漿液以4 000 r·min-1離心10 min，上清液為樣品提取液。吸取2 mL提取液于試管中，加入2 mL 0.6%硫代巴比妥酸(用10%TCA配制 0.6%的 TBA 溶液)，1 mL 0.1%FeCl3，混勻，塑料薄膜封口，置于沸水浴中沸煮15 min，迅速冷卻，5 000 r·min-1離心10 min。取上清液測定600 nm、532 nm和450 nm的OD值。

超氧陰離子水平測定參照蕭華山［17］的方法。

過氧化氫含量測定參照Patterson BD［18］等人方法。

1.2.6 SOD和CAT活性及Vc含量測定

SOD活性測定參照邵從本等人方法［19］。以能抑制反應(yīng)50%的酶量為一個SOD酶單位。SOD總活性=(A0-As)×V/0.5×A0×W×Vt(A0對照管的OD值;As為樣品管的OD值;V為樣品總體積;Vt為測定時樣品用量;W為樣品干重)。

CAT活性測定參照 Chance［20］方法，并做進(jìn)一步修改。稱取0.5 g發(fā)菜，加入3～5 mL的65 mmol·L-1磷酸緩沖液(pH 7.4)，冰浴研磨，終體積為15 mL，在 10 500 r·min-1下離心 30 min，上清液為粗酶液。取粗酶液 0.5 mL，加入 0.5 mL 10 mmol·L-1的 H2O2，37 ℃水浴 2 min，立即加入 0.3 mL 5%硫酸鈦，加入1 mL飽和氯化鈉，最后加入3 mL 2 mol·L-1硫酸，在415 nm下測定其 OD值，表示為A 測;取粗酶液 0.5 mL，1 mL 飽和氯化鈉，0.5 mL 10 mmol·L-1的 H2O2，37 ℃ 水浴 2 min，立即加入0.3 mL 5% 硫酸鈦，加入 3 mL 2 mol·L-1硫酸，在415 nm下測定其OD值表示為，A對。以分解H2O2的量表示CAT酶活性，CAT活性按如下公式計算:CAT 活性 =(C對-C測)·Vt/(V測·DW·t)。其中，C對為A對查標(biāo)準(zhǔn)曲線的值;C測為A測查標(biāo)準(zhǔn)曲線的值;Vt為提取液總體積;V測為測定用體積;DW為樣品干重;t為反應(yīng)時間。

Vc含量測定參照周有文［21］等人的方法。稱取1 g發(fā)菜，加入5 mL草酸-EDTA研磨成勻漿，終體積為15 mL，在3 000 r·min-1下離心15 min，上清液即為Vc提取液。取上清液1 mL，加入4 mL草酸-EDTA，1.5 mL偏磷酸-醋酸，2 mL 5%硫酸，4 mL 5%鉬酸銨，30℃水浴15 min，在730 nm下測定其OD值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本實驗數(shù)據(jù)采用SPSS V17.0進(jìn)行單因素方差分析Scheffe檢驗。表中數(shù)據(jù)為10次平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，圖中誤差線為3次重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差。

圖1 野生干燥發(fā)菜與儲存10年干燥發(fā)菜營養(yǎng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)比較Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ野生干燥發(fā)菜營養(yǎng)細(xì)胞;Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ為儲存一年的發(fā)菜營養(yǎng)細(xì)胞;Ⅰ、Ⅳ:3 000×;Ⅱ、Ⅴ:5 000×;Ⅲ、Ⅵ:12 000×;CW.細(xì)胞壁;G.糖原顆粒;fb.假空泡;Pb.多角體;Sg.結(jié)構(gòu)顆粒;S.膠質(zhì)鞘;T.類囊體膜

2 結(jié)果與分析

2.1 野生和長期儲存干燥發(fā)菜超微結(jié)構(gòu)的比較

野生干燥發(fā)菜和儲存10年的干燥發(fā)菜膠質(zhì)鞘和細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞近似圓形，直徑2～3μm;細(xì)胞壁分為4層，厚度為30 nm左右，細(xì)胞內(nèi)有多面體、糖原顆粒等結(jié)構(gòu)(圖1，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ)。與野生干燥發(fā)菜相比較，儲存10年的干燥發(fā)菜膠質(zhì)鞘層較稀疏(圖1，Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ)，糖原顆粒數(shù)目減少，而結(jié)構(gòu)顆粒數(shù)目沒有明顯變化(圖1，Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ)(圖1)。

2.2 野生和長期儲存發(fā)菜光合生理的比較

儲存10年的干燥發(fā)菜無凈光合速率(圖2，A)，其暗呼吸速率、葉綠素a、藻藍(lán)素、別藻藍(lán)素和藻紅素比野生干燥發(fā)菜分別降低了1400%，(p＜0.01)(圖 2，B)、45.83%(P ＜0.01)(圖 2，D)、248.46%(P ＜0.01)(圖2，E)、109.94%，(P ＜0.01)(圖2，E)和262.19%(P ＜0.01)(圖 2，E)，而類胡蘿卜素含量顯著升高，增加量達(dá)96.58%(P ＜0.01)(圖2，C)。

2.3 野生和長期儲存發(fā)菜滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的比較

與野生干燥發(fā)菜相比，長期儲存干燥發(fā)菜脯氨酸(圖2，A)、可溶性蛋白(圖3，B)和可溶性糖含量(圖 3，C)分別增加了 38.28%(P ＜0.05)、24.49%(P ＜0.05)和24.03%(P ＜0.05)。

2.4 野生和長期儲存干燥發(fā)菜活性氧代謝的比較

與野生干燥發(fā)菜相比，長期儲存干燥發(fā)菜的丙二醛含量(圖4，A)、H2O2含量(圖4，B)和超氧陰離子自由基含量(圖4，C)分別增加了5.84%(p＜0.05)、58.38%(P ＜0.05)和 63.46%(P ＜0.05)。而SOD活性(圖4，D)、CAT 活性(圖4，E)和 Vc含量(圖 4，F(xiàn))則分別增加了 6.97%(P ＜0.05)、12.49%(P ＜0.05)和27.53%(P ＜0.05)。

2.5 野生和長期儲存干燥發(fā)菜生理學(xué)指標(biāo)相關(guān)性分析

對野生和長期儲存干燥發(fā)菜生理學(xué)指標(biāo)相關(guān)性分析表明，凈光合速率分別與葉綠素a、藻膽素呈顯著正相關(guān)(p＜0.05)，與類胡蘿卜素呈顯著負(fù)相關(guān)(p＜0.05)，與暗呼吸速率呈極顯著正相關(guān)(p＜0.01);暗呼吸速率與凈光合速率呈極顯著正相關(guān)(p＜0.01)與葉綠素a、藻膽素呈顯著正相關(guān)(p＜0.05)，與類胡蘿卜素呈極顯著負(fù)相關(guān)(p＜0.01);葉綠素a與藻膽素呈顯著正相關(guān)(p＜0.05);類胡蘿卜素與暗呼吸速率呈極顯著負(fù)相關(guān)(p＜0.01);藻藍(lán)素與別藻藍(lán)素含量呈極顯著正相關(guān)(p＜0.01)，與藻紅素呈正相關(guān)(p＜0.05);別藻藍(lán)素分別與藻藍(lán)素、藻紅素含量呈極顯著正相關(guān)(p＜0.01);藻紅素與別藻藍(lán)素呈極顯著正相關(guān)(p＜0.01)，與藻藍(lán)素呈正相關(guān)(p＜0.05)。而脯氨酸含量分別與可溶性蛋白、可溶性糖呈顯著正相關(guān)(p＜0.05)，可溶性蛋白分別與脯氨酸、可溶性糖含量呈顯著正相關(guān)(p＜0.05)，可溶性糖分別與脯氨酸、可溶性蛋白呈顯著正相關(guān)(p＜0.05)。此外，丙二醛含量與SOD活性呈顯著正相關(guān)p＜0.05)，H2O2含量與Vc含量呈顯著正相關(guān)p＜0.05)，超氧陰離子自由基含量與Vc含量量呈顯著正相關(guān)p＜0.05)，CAT活性與Vc含量呈顯著正相關(guān)p＜0.05)，Vc含量與H2O2含量、超氧陰離子自由基含量、CAT活性呈顯著正相關(guān)p＜0.05)(表1)。

圖2 野生干燥發(fā)菜與儲存10年干燥發(fā)菜光合活性和光合色素含量的變化

圖3 野生干燥發(fā)菜與儲存10年干燥發(fā)菜脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖含量的比較

圖4 野生干燥發(fā)菜與儲存10年干燥發(fā)菜丙二醛、H2 O2、超氧陰離子自由基含量和SOD、CAT活性及Vc含量的變化

表1 野生干燥發(fā)菜與儲存10年干燥發(fā)菜生理指標(biāo)相關(guān)性分析

3 討論

3.1 長期儲存對發(fā)菜細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響

發(fā)菜是一種生長在干旱-半干旱荒漠草原地區(qū)的陸生固氮藍(lán)藻，經(jīng)常遭受溫度、水分、光照等環(huán)境因子的變化的影響，因而對極端環(huán)境有很強(qiáng)的適應(yīng)性。Liang［22］等研究表明，持續(xù)失水48 h的發(fā)菜外表干燥、皺縮，但藻體、藻絲體、膠鞘和細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，類囊體膜及細(xì)胞內(nèi)顆粒物質(zhì)無明顯變化，恢復(fù)吸水4 h后，藻體膨脹，藻體和細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，但細(xì)胞內(nèi)液泡的數(shù)量和體積比干燥發(fā)菜細(xì)胞的多;周有文等［21］研究表明，發(fā)菜隨著含水量降低，其膠質(zhì)鞘趨于緊密，類囊體結(jié)構(gòu)逐漸模糊，排列紊亂，糖原顆粒隨著水分散失，數(shù)目減少，但結(jié)構(gòu)顆粒數(shù)目沒有明顯變化。本研究表明，長期儲存的發(fā)菜膠質(zhì)鞘層緊密，糖原顆粒數(shù)目減少，但藻體和細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，表明在長期儲存過程中，雖然發(fā)菜的生長代謝受到抑制，但由于藻體及細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，這就為條件適宜時恢復(fù)生理活性奠定了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，是發(fā)菜耐長期儲藏而仍能恢復(fù)生命活力的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

3.2 長期儲藏對發(fā)菜光合生理的影響

發(fā)菜在干燥或脫水條件下凈光合速率和暗呼吸速率呈明顯下降趨勢，這些變化可能與能量代謝相關(guān)的部分蛋白下調(diào)表達(dá)有關(guān)［23］。長期儲存的干燥發(fā)菜能夠在一定條件下恢復(fù)生理活性依賴于其獨特的光恢復(fù)特性［22］。在長期儲存過程中，由于干燥脫水、避光等環(huán)境因素，發(fā)菜的生理活性極度微弱，光合作用停止，呼吸作用下降，葉綠素a和藻膽素(藻藍(lán)素、別藻藍(lán)素和藻紅素)含量下降，凈光合速率分別與葉綠素a、藻膽素呈顯著正相關(guān)(p＜0.05)，與類胡蘿卜素呈顯著負(fù)相關(guān)，與暗呼吸速率呈極顯著正相關(guān)(p＜0.01)，這些變化是發(fā)菜對環(huán)境變化的一種適應(yīng)與保護(hù)。此外，葉綠素a和藻膽素含量減少可使其對光能的捕獲能力降低，從而降低光合系統(tǒng)遭受破壞的風(fēng)險，這也是發(fā)菜適應(yīng)長期儲存的一種光保護(hù)調(diào)節(jié)機(jī)制。

3.3 長期儲存對發(fā)菜抗性生理的影響

植物在呼吸作用過程中，細(xì)胞會持續(xù)不斷地產(chǎn)生活性氧自由基(ROS)［25］。過量ROS的產(chǎn)生和積累會導(dǎo)致氧化性脅迫、細(xì)胞組成和結(jié)構(gòu)的損壞及細(xì)胞功能的喪失。此外，ROS還可能充當(dāng)信號分子啟動一些系列信號傳導(dǎo)途徑，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡(PCD)［25-26］。因此，細(xì)胞內(nèi)氧化和抗氧化體系的平衡對細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能、調(diào)控及適應(yīng)多樣化的生長環(huán)境是至關(guān)重要的［27］。為了克服氧化性脅迫，植物發(fā)展了依賴于酶和非酶的抗氧化防御系統(tǒng)，以達(dá)到清除多余ROS的目的［28］。發(fā)菜在脫水48 h時，凈光合速率、暗呼吸速率、總Rubisco活性、超氧陰離子水平、SOD、CAT、POD活性以及固氮酶和谷氨酰胺合成酶活性明顯下降，而H2O2、氨和脯氨酸含量增加［24］。本研究表明，長期儲存發(fā)菜與野生干燥發(fā)菜相比，丙二醛、H2O2、超氧陰離子自由基和Vc含量以及SOD活性和CAT活性呈顯著升高(圖4)，而且滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)如脯氨酸、可溶性蛋白與可溶性糖含量都明顯高于野生干燥發(fā)菜(圖3)。相關(guān)性分析表明，丙二醛含量與SOD活性呈顯著正相關(guān)，H2O2含量與Vc含量呈顯著正相關(guān)，超氧陰離子自由基含量與Vc含量量呈顯著正相關(guān)，CAT活性與Vc含量呈顯著正相關(guān)，Vc含量與H2O2含量、超氧陰離子自由基含量、CAT活性呈顯著正相關(guān)(表1)。分析認(rèn)為，發(fā)菜在長期儲存過程中，雖然生理活性處于極度微弱或生理休眠狀態(tài)，但仍有ROS的積累，與此相應(yīng)的抗氧化酶也處于較高水平，SOD、CAT和Vc等協(xié)同作用，共同維持活性氧代謝的平衡，這也反映了發(fā)菜耐長期儲存的適應(yīng)和保護(hù)策略。此外，長期儲存的發(fā)菜中的類胡蘿卜素含量明顯高于野生干燥發(fā)菜(圖2，C)。類胡蘿卜素作為光合作用的輔助色素，不僅參與執(zhí)行光能傳遞和物質(zhì)轉(zhuǎn)化，而且具有抗光敏化作用、碎滅自由基等重要生理功能。而在長期儲藏的發(fā)菜中，類胡蘿卜素如何既要與SOD和CAT等抗氧化酶協(xié)調(diào)抗氧化性脅迫，又要與葉綠素a和藻膽素等協(xié)調(diào)光能傳遞和物質(zhì)轉(zhuǎn)化，這一問題有待深入研究。

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