五味子木脂素的功能性及其提取鑒定

谷艷菲，閆伯前，丁 軻，韓 濤*

(1.農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測與控制北京市重點實驗室，北京102206;2.北京農(nóng)學院 食品科學與工程學院，北京102206)

五味子［Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.］，別名味子、藥葡萄、山花椒，為木蘭科五味子屬(Schzsancra Michx)藤本植物，是生長在我國溫帶針闊葉混交林帶區(qū)域和暖溫帶落葉闊葉林區(qū)域、歷經(jīng)第四紀冰川時期保留下來的第三紀古老植物之一［1］?！吨腥A人民共和國藥典》收錄有兩種五味子:北五味子［Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.］和南五味子(Schisandra sphenanthera Rehd.et Wils)［2］，其中北五味子習稱為“五味子”［3］?！侗静菥V目》中記載:“五味子今有南北之分，南產(chǎn)者紅北產(chǎn)者黑，入滋補藥，必用北者為良”［4］。

五味子呈不規(guī)則的球形或扁球形，直徑5～8 mm。外表皮呈鮮紅色、紫紅色或暗紅色，有不整齊的皺縮，顯油潤，有的表面呈黑紅色或出現(xiàn)“白霜”;果肉柔軟，氣微弱而特殊，味酸［5］。

在我國，五味子主要分布在黃河流域以北，包括黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、河北、山西、寧夏、甘肅、山東，其中東北是產(chǎn)量最集中的地區(qū)，尤以遼寧為其地道藥材產(chǎn)地，因此，五味子又稱“遼五味”;唐《新修本草》載:“五味皮肉甘酸，核中辛苦，都有咸味”，故有五味子之名［5］。五味子具有藥用及營養(yǎng)價值，《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載:“五味子主治益氣，咳逆上氣，勞傷羸瘦;補不足，強陰，益男子精”;《藥性本草》中謂:“五味子能治中下氣，止嘔逆，補虛癆，令人體悅澤”。衛(wèi)生部于2000年印發(fā)的《可用于保健食品的物品名單》中，明確說明五味子可用于生產(chǎn)保健食品。

木脂素是一類主要通過p－羥基苯乙烯單體氧化耦合而成的、在植物中廣泛分布的小分子量次生代謝產(chǎn)物［6］。由于最早從木質(zhì)部和樹脂中發(fā)現(xiàn)，且分布較多，故而得名木脂素［7］。五味子屬木脂素類化合物是以1，2，3，4－ 聯(lián)苯 －1，3－ 環(huán)辛二烯為母核的木脂素，是五味子中最主要的藥理活性成分［8］;國內(nèi)外學者已經(jīng)從五味子屬中分離得到的木脂素類單體化合物有150多種，其中具有明顯生物活性的單體包括:五味子甲素(Deoxyschisandrin)、五味子乙素(Schisandrin B)、五味子丙素(Schisandrin C)、五味子醇甲(Schisandrol A)、五味子醇乙(Schisandrol B)、五味子酯甲(Schisantherin A)、五味子酯乙(Schisantherin B)、戈米辛A(Gomisin A)等［9］。王品等［10］采用高效液相色譜法測定北五味子種子、果肉、藤條、葉、根中的五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲、五味子酯甲的含量，結(jié)果表明以上部位都含有木脂素，其中五味子醇甲含量最高，五味子乙素次之，五味子甲素最低。采用已烷提取、薄層掃描法測定北五味子不同部位總木脂素含量分別為:根1.193%、莖1.614%、葉0.161%、果實1.415%，表明北五味子果實和莖的總木脂素含量相近［11］。

1 五味子木脂素的藥用功能及其藥理

1.1 對肝臟的保護作用

《中國藥典》2000年版及衛(wèi)生部藥品衛(wèi)生標準共收載含五味子的制劑327種，其中80%具保肝護肝療效［9］。

五味子能降低轉(zhuǎn)氨酶，臨床用于治療慢性肝炎。以四氯化碳、硫代乙酰胺和乙炔雌二醇環(huán)戊醚引起的小鼠肝損傷為模型，五味子中提取的甲素、乙素、丙素、醇甲、醇乙、酯甲和酯乙均有不同程度降低血清轉(zhuǎn)氨酶升高的作用，明顯降低動物肝內(nèi)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(SGPT)活性，而對谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、乳酸脫氫酶(LDH)及醛縮酶(ALD)活性無影響;其中以五味子酯乙作用最強、醇乙次之，丙素再次之［12］。五味子乙素可以通過提高肝臟的細胞谷胱甘肽(GSH)水平保護小鼠的四氯化碳肝損傷［13－14］。五味子中的戈米辛A對四氯化碳、半乳糖胺和乳清酸所致的小鼠肝損傷模型有保護作用，并發(fā)現(xiàn)其對抗堿性肝蛋白抗體、抗肝特性蛋白和短小棒狀桿菌苗及脂多糖誘發(fā)的免疫肝損傷產(chǎn)生作用時，除明顯降低小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶活性外，還顯示出抑制肝損傷的病理變化［15］。

1.2 對心血管的保護作用

高思海等［16］在對大鼠心臟移植術(shù)供體心的保護實驗中發(fā)現(xiàn)，在心臟停搏后，五味子酚可促進大鼠左心功能的恢復(fù)，可有效保護心肌結(jié)構(gòu)和功能，降低心肌耗氧量，延長供體心的保存時間。五味子木脂素可緩解PGF2α引起的離體狗腸系膜動脈收縮，抑制氯化鈣引起的血管收縮，其機理可能是通過阻滯血管平滑肌細胞膜上的電壓依賴性鈣通道而發(fā)揮作用的［17－18］。

1.3 對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制作用

五味子醇甲具有廣泛的中樞抑制作用。通過給小鼠腹腔注射五味子醇甲，可明顯延長小鼠戊巴比妥鈉的睡眠時間，減少小鼠自主活動;將注射五味子醇甲的小鼠后肢放在水平衡木上，小鼠發(fā)生木僵反應(yīng)，再給小鼠腦室注射神經(jīng)遞質(zhì)，木僵反應(yīng)減弱，說明腦室注射神經(jīng)遞質(zhì)可對抗五味子醇甲導(dǎo)致的木僵;五味子醇甲可抑制電刺激及單獨飼養(yǎng)引起的小鼠激怒行為;此外，還能明顯對抗電休克及尾靜脈注射中樞興奮藥引起的小鼠強直性驚厥［19］。

1.4 對神經(jīng)元的保護作用

過氧化氫是活性氧族的主要成分之一，在代謝過程中產(chǎn)生活性氧和自由基導(dǎo)致細胞凋亡，引起神經(jīng)元損害［20－21］。采用大鼠嗜鉻細胞瘤細胞(PC12細胞)，用H2O2處理，建立細胞缺氧模型，模擬神經(jīng)細胞的能量代謝障礙，利用流式細胞儀測定PC12細胞的線粒體膜電位，觀察五味子總木脂素對PC12細胞凋亡的保護作用，結(jié)果線粒體膜電位上升，說明五味子木脂素可抑制線粒體膜開放，降低線粒體膜通透性，維持其跨膜電位的穩(wěn)定，維護線粒體膜的屏障功能，從而發(fā)揮對H2O2誘導(dǎo)PC12細胞凋亡的保護作用［22］。

1.5 抗氧化作用

皮子鳳等［23］研究了五味子木脂素對大鼠肝臟、腦組織脂質(zhì)過氧化的抑制活性及對自由基(·DPPH)的清除作用，結(jié)果表明，五味子甲素、五味子醇甲、五味子醇乙是主要的抗氧化活性成分，其中五味子醇乙的抗氧化能力最強，五味子甲素的抗氧化能力最弱。五味子乙素提取液對羥基自由基(·OH)的半數(shù)清除質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，清除作用大于相同質(zhì)量濃度的抗壞血酸;對超氧陰離子自由基()的半數(shù)清除質(zhì)量濃度為0.24 mg/mL，清除作用小于抗壞血酸［24］。五味子乙素對四氯化碳和硫酸鐵/半胱氨酸這兩種自由基產(chǎn)生系統(tǒng)所引發(fā)的肝細胞丙二醛生成均有顯著的抑制作用，且呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，丙二醛生成量隨五味子乙素劑量遞增而減少，特別是對硫酸鐵損傷造成的丙二醛生成，抑制作用更為顯著［25］。

1.6 抗腫瘤作用

禹潔等［26］通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，五味子木脂素對人乳腺癌細胞MCF－7和肝癌細胞HepG2的抑制效果明顯，50μg/mL的抑制率已高于50%。其機理可能是調(diào)控細胞凋亡相關(guān)基因蛋白的表達，促使細胞周期停滯，細胞凋亡，達到抗腫瘤作用［27－28］。五味子乙素能提高抗癌藥物奧沙利鉑對耐奧沙利鉑結(jié)腸癌細胞的抑制增殖作用，并顯著降低奧沙利鉑對耐奧沙利鉑結(jié)腸癌細胞的半數(shù)抑制濃度，表明五味子乙素可逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞多耐藥性，增加抗腫瘤藥物的敏感性［29］。

1.7 抗HIV作用

五味子木脂素具有抗HIV的活性，主要是由于其對HIV整合酶具有強抑制作用，并能夠抑制HIV的逆轉(zhuǎn)錄過程，其中二溴衍生物的活性比其天然產(chǎn)物具有更強的作用，且具有更好的選擇性［30］。

1.8 降血脂作用

高脂血癥是動脈硬化及冠心病的重要病因，也是心肌缺血再灌注的病理基礎(chǔ)，因此可用高脂血癥模型作為研究平臺，進行冠心病及缺血－再灌注損傷等相關(guān)研究。孫瀟等［31］給高脂血癥模型大鼠灌胃五味子木脂素，結(jié)果顯示可以顯著降低其血清甘油三脂(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL－c)的水平，明顯提高血清高密度脂蛋白膽固醇(HDL－c)水平，表明五味子木脂素可有效地糾正高脂血癥動物的脂質(zhì)代謝紊亂，對高脂飲食所致高脂血癥具有良好的防治作用。

1.9 增強記憶力

五味子木脂素可延長戊巴比妥鈉記憶障礙模型小鼠在Morris水迷宮測試的有效區(qū)停留時間及平臺停留時間，對小鼠學習記憶損傷有改善作用［32］。

圖1 五味子主要功能單體木脂素功能圖

2 五味子木脂素的提取工藝

目前，五味子木脂素的提取常用溶劑提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、超高壓提取法及超臨界CO2萃取技術(shù)。

溶劑提取法，是一種從中草藥中提取有效成分的簡單方法。魏小川［33］研究了回流提取北五味子總木脂素的工藝參數(shù):料液比1∶4，80%乙醇提取3次，每次3 h，提取率為 0.704%。袁海龍等［34］研究了回流提取五味子甲素的工藝參數(shù):料液比1∶5，90%乙醇提取2次，每次60 min，得到五味子甲素1.06 mg/g。五味子乙素回流提取的工藝參數(shù):料液比1∶5，85%乙醇提取120 min，得到五味子乙素2.91 mg/g［35］。五味子醇甲回流提取的工藝參數(shù):料液比1∶10，65%乙醇提取160 min，得到五味子醇甲 0.581%［36］。

超聲波提取法利用其強烈震蕩和空化作用，使有效組分迅速溶解于提取液［37］。楊磊等［38］用超聲提取法提取五味子木脂素，以81.21%乙醇為溶劑，料液比 1∶7.95，超聲功率 222.5 W，超聲時間 29.87 min，提取3次，總木脂素得率可達到1.536%;以85%乙醇作為超聲提取溶劑，超聲功率500 W，超聲時間為10 min，溫度為30℃，料液比1:20，得到的總木脂素含量為2.46%［39］。以90%乙醇為提取溶劑，料液比為 1∶10，超聲頻率 74.4 Hz，超聲 40 min，得到五味子乙素 2.11 mg/g［40］。

微波輔助提取法具有提取物純度高、質(zhì)量好，可有效保護提取物功能成分等優(yōu)點。黃惠華等［41］分別以乙醇和水作為溶劑，微波萃取五味子中的五味子醇甲，微波功率350 W，時間5～8 min，液固比12∶1，水萃取溫度95℃，產(chǎn)率0.47%，乙醇萃取溫度72℃，產(chǎn)率0.72%。

超聲波與微波協(xié)同萃取，能明顯提高五味子甲素的得率，如在超聲波工作狀態(tài)下，當微波功率為60 W，乙醇濃度80%，料液比為1∶20，浸提2次，每次為10 min，得到五味子甲素0.728 mg/g;同樣條件下，回流提取得到五味子甲素僅 0.432 mg/g［42］。

劉長姣等［43］用超高壓提取法提取五味子總木脂素，得到的工藝參數(shù)為，壓力350 MPa，溶劑為70%乙醇，固液比為1∶90，總木脂素得率為3.54%。

超臨界CO2萃取技術(shù)提取五味子木脂素，萃取壓力30 Mpa，萃取溫度50℃，萃取時間120 min，CO2流量為 10 g/h，五味子總木脂素得率1.015%［44］;萃取壓力為30 Mpa，萃取溫度45℃，萃取時間為120 min，CO2流量為15 L/h，五味子總木脂素的萃取得率可達1.024%［45］;提取壓力 25 MPa，提取溫度35 ℃，CO2流量2 L/min，五味子總木脂素得率1.53%［46］。

法多索溶劑系統(tǒng)主要由1，1，1，2－四氟乙烷組成，可配合手握式提取器提取天然藥物。劉本等［47］比較了法多索溶劑和10%甲醇調(diào)節(jié)的超臨界CO2提取五味子甲素的提取率，法多索溶劑提取率為0.45%，與10%甲醇調(diào)節(jié)的超臨界CO2的提取率0.48%相近，但前者成本和能耗較低，更適合大規(guī)模提取。

3 五味子木脂素的純化

五味子木脂素常用的純化方法有色譜分離法、吸附柱色譜及分配柱色譜［48］。

薛雪等［49］研究了不同型號大孔吸附樹脂及不同工藝條件對總木脂素分離純化的效果，其中AB－8型大孔樹脂純化總木脂素可達到最佳效果，總木脂素濃度為1.511 mg/mL時，最大上樣量約為6倍柱床體積，洗脫流速1 mL/min，蒸餾水洗脫體積為8倍柱床體積，洗脫劑95%乙醇用量為5倍柱床體積，總木脂素的洗脫率可達到78.89%。五味子木脂素粗提物經(jīng)硅膠層析后，利用高速逆流色譜進行純化，溶劑體系為正己烷 －甲醇 －水(7∶6∶1，體積比，下同)，轉(zhuǎn)速為 800 r/min，流速為 2.0 mL/min，時間為4 h，分離出純度為99.9%的五味子酚、98%的五味子甲素、97%的五味子乙素和99%的五味子酯甲［50］。高速逆流色譜法對五味子石油醚提取物進行純化，溶劑體系為正己烷－甲醇－水(35∶30∶3)，轉(zhuǎn)速為 950 r/min，流速為 1.0 mL/min，分離出純度為98%的五味子甲素和96%的五味子乙素［51］。五味子乙醇提取物先經(jīng)D101型大孔樹脂初步純化，再用高速逆流色譜法進一步純化，使用兩相溶劑系統(tǒng)，正己烷－乙酸乙酯－甲醇－水(10∶9∶9∶10)，轉(zhuǎn)速為 800 r/min，流速為 2.2 mL/min，得到濃度為99.5%的五味子素和99.1%的戈米辛 A［52］。

4 五味子木脂素的含量測定及鑒定

4.1 木脂素的含量測定

五味子木脂素常用的檢測方法有分光光度法、薄層色譜法和高效液相色譜法［53］。

郝書文等［54］用變色酸比色法于570 nm波長處測定北五味子乙素含量，測得含量為1.18%。

韓正洲等［55］采用薄層色譜法測定了五味子甲素、乙素的含量:將樣品與對照品分別加氯仿回流提取，再以氯仿溶解殘渣，點樣品于GF254薄層板上，以石油醚(60～90℃)－乙酸乙醋－甲酸(15∶5∶1)為展開劑展開，在紫外燈254 nm下觀察熒光碎滅點進行定性，200～370 nm波長處進行光譜掃描測定，結(jié)果表明五味子甲、乙素及樣品在220 nm波長處有最大吸收，而在300 nm波長處吸收較小。

高效液相色譜法測定五味子木脂素含量，方法簡便可行。鄭春英等［56］采用 Symmetry C18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm)、甲醇 － 乙腈 － 水(1∶1∶1)作流動相、流速1 mL/min、檢測波長250 nm，同時測定了3種五味子木脂素成分。黃文倩等［57］選用Angilent XDB C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)、甲醇(A)－冰醋酸(B)為流動相梯度洗脫、流速0.9 mL/min、柱溫35℃、檢測波長254 nm，同時測定了6種五味子木脂素成分。胡俊揚等［58］選用ODS－C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm，5μm)、乙腈(A)－水(B)為流動相梯度洗脫、流速1.0 mL/min、柱溫30℃、檢測波長217 nm，同時測定了8種五味子木脂素成分。

4.2 木脂素的鑒定

向智敏等［59］用氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法分析五味子超臨界CO2提取物，鑒定出7種木脂素成分，占色譜峰總面積的80.5%，其中含五味子乙素30.58%、五味子醇甲16%、五味子醇乙15.17%、五味子甲素9.39%、五味子丙素5.95%。

5 五味子木脂素在食品工業(yè)中的應(yīng)用前景

目前，市場上除五味子原料外，現(xiàn)有的五味子產(chǎn)品多為(中成藥)藥品或簡單滿足口感需求的傳統(tǒng)加工產(chǎn)品(醬、汁等)，由于五味子木脂素具有一定的保護肝臟及心血管、抗腫瘤、抗氧化、促進睡眠等功效，未來可開發(fā)五味子保健食品(產(chǎn)品)。未來的方向?qū)⒊浞治兆钚吕碚摮晒?，結(jié)合社會對健康產(chǎn)品的需要，利用現(xiàn)代科學技術(shù)手段，開發(fā)將著眼于在產(chǎn)品中最大程度富集木脂素等有效成分，強化產(chǎn)品的保健作用或與其它功能成分的配伍。在產(chǎn)品的加工工程中，更加重視既要保證口感，還要保證五味子有效成分不被破壞，發(fā)揮其保健功效。

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