不同血清濃度對淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)的影響

葛敏 蔣朝華 戴婷婷 程佳 李圣利

淋巴系統(tǒng)對于維持人體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定、引流組織間隙的體液、免疫功能的發(fā)揮具有重要的意義，這些功能的發(fā)揮與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞（Lymphatic endothelial cells，LECs）的功能密切相關(guān)。淋巴管生成（lymphangiogenesis）是在既存淋巴管基礎(chǔ)上的淋巴管新生。在炎癥及腫瘤過程中，淋巴管生成參與了組織的修復(fù)及腫瘤的轉(zhuǎn)移[1-2]。這是目前淋巴學(xué)研究領(lǐng)域的重要內(nèi)容，也是研究淋巴管畸形、淋巴水腫以及腫瘤轉(zhuǎn)移等疾病的基礎(chǔ)。LECs培養(yǎng)不易，成活和傳代較困難，是目前亟需解決的問題。

本實驗采用不同血清濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)LECs，探討不同血清濃度對于LECs培養(yǎng)的影響，探索穩(wěn)定、高效的LECs培養(yǎng)方法，為組織工程構(gòu)建淋巴管的研究提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

EGM-2-MV（Lonza 公司，美國）；DMEM-高糖（Hyclone公司，澳大利亞）；胰酶/EDTA消化液（Hyclone公司，澳大利亞）；膠原酶（Serva公司，德國）；中性蛋白酶 （Roche公司，美國）；流式抗體Podoplanin（eBioscience 公司，美國）；低密度脂蛋白Dil-Ac-LDL（Invitrogen 公司，美國）；metrigel（BD 公司，美國）；免疫熒光抗體podoplaningon（Angiobio公司，美國）；PCR 引物（捷瑞生物公司，中國）；CD31陽性磁珠(Dynal公司，美國)；纖維連接蛋白（Sigma公司，美國）；血清（Gibco 公司，美國）。

1.2 儀器設(shè)備

超凈工作臺（上海醫(yī)療器械公司）；CO2培養(yǎng)箱（GmbH公司，德國）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；流式細(xì)胞儀（BD 公司，美國）；M-CBAD全自動顯微照相機(jī)（Olympus公司，日本）；PCR儀（Biometra公司，德國）。

1.3 細(xì)胞分離和培養(yǎng)

經(jīng)知情同意后，留取環(huán)切術(shù)幼兒包皮，徹底洗凈，去除皮下疏松組織，中性蛋白酶結(jié)合膠原酶消化，CD31陽性磁珠分選獲得CD31+細(xì)胞[3]。用完全內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基EGM-2重懸，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105cells/mL后，接種于用20 ng/mL纖維連接蛋白鋪底的6孔板中培養(yǎng)。5～6 d換液1次。細(xì)胞生長到90%融合后，0.05%的胰蛋白酶消化，1∶3傳代于6孔板中。

1.4 細(xì)胞鑒定

1.4.1 細(xì)胞免疫熒光鑒定[4-6]

4%多聚甲醛固定10min，PBS漂洗3次，滴加兔抗人 Podoplanin 抗體（1∶500），4 ℃過夜；PBS 漂洗3次，滴加PE熒光二抗，37℃孵育30min；PBS漂洗 3 次，加入 DAPI（1∶1000），PBS 漂洗 3 次，熒光顯微鏡觀察。

1.4.2 細(xì)胞RT-PCR鑒定[7-8]

取第3代CD31+細(xì)胞，Trizol法進(jìn)行RNA抽提。RT 反應(yīng)體系：25 mmol/L MgCl24μL，10×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液 2μL，10 mmol/L dNTP 2μL，40 U/μL RNase 抑制劑 0.5μL，5 U/μL AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶 1μL，200 ng/μL Oligo dT-Adaptor Primer 1μL，RNA 2 μg， 加 無RNase水至 20μL。RT反應(yīng)條件：30℃10min，42 ℃60min，99 ℃5min，5 ℃5min。 PCR 引物序列：人Prox-1上游引物為5'-CTCATAAAGTCCGAGTGCG-3'，下游引物為5'-AACATCTTTGCCTGCGATA-3'，產(chǎn)物 446 bp；人 Podoplanin上游引物為 5'-GTGTAACAGGCATTCGCATCG-3'，下游引物為 5'-GGCAAGTGTTCCACGGGTC-3'， 產(chǎn)物 321 bp；人Lyve-1上游引物為5'-GTTTCTTTCATGCTCCTTACCC-3'，下游引物為 5'-GTCTCAGTGACTCCTTGGCTTT-3'，產(chǎn)物 354 bp；人 VEGFR-3 上游引物為5'-CATCCAGCTGTTGCCCAGG'，下游引物為5'-GAGCCACTCGACGCTGATGAA-3'，產(chǎn)物 321 bp；人β-actin上游引物為5'-ATCATGTTTGAGACCTTCAA-3'，下游引物為 5'-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3'，產(chǎn)物 318 bp。反應(yīng)體系：ddH2O 13.2μL，25 mmol/L MgCl21.6μL，10×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液2μL，10 mmol/L dNTP 0.5μL，5 U/μL Taq 酶 0.5μL，cDNA 1.0μL，20 pmol/μL 目的基因上下游引物各0.3μL。 反應(yīng)條件：95 ℃變性 5min；95 ℃ 30 sec、55 ℃30 sec、72 ℃ 30 sec，共 35個循環(huán)；72 ℃延伸 10min。電泳、圖像分析：PCR產(chǎn)物10μL經(jīng)1.2%瓊脂糖，70 V電壓電泳1.5 h后，進(jìn)行圖像分析。

1.4.3 流式細(xì)胞儀鑒定

淋巴管內(nèi)皮特異性標(biāo)志Podoplanin鑒定：消化制備單細(xì)胞懸液，第3代細(xì)胞生長到90%融合后，0.05%胰蛋白酶消化，DMEM培養(yǎng)液終止消化，含4%胎牛血清（FBS）的PBS稀釋打勻，單細(xì)胞濾器過濾，1500 r/min離心5min，棄上清，沉淀細(xì)胞用含4%FBS的PBS重懸，打勻，計數(shù)，配成1×106cells/mL細(xì)胞懸液備用。冰盒上操作，細(xì)胞懸液分裝入流式細(xì)胞儀專用檢測試管，每管約2×105個細(xì)胞，設(shè)空白組和對照組，對照組每管加Podoplanin流式抗體10μL，空白組不加抗體。4℃孵育30min，每管加含4%FBS的PBS 1 mL，1500 r/min離心5min， 洗3次，洗脫多余抗體。加 200μL含4%FBS的PBS重懸，上機(jī)檢測。

1.5 細(xì)胞的不同血清培養(yǎng)基培養(yǎng)及鑒定

原代LECs傳至第1代時將細(xì)胞分為5組，分別加入血清濃度為0、2.5%、5%、7.5%、10%的EGM-2培養(yǎng)基。傳至第3代時進(jìn)行鑒定。

鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)。5組LECs按照每孔3×103個的濃度接種于96孔板，24h后加入CCK-8，4h后采用酶標(biāo)儀所測OD值（450 nm），之后每24小時測1次，連續(xù)9 d，繪制細(xì)胞增殖曲線。

成管能力檢測：將metrigel按照說明書鋪于6孔板，置于培養(yǎng)箱待其凝固，將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整至2×104cells/mL，按照每孔1 mL分別將5組細(xì)胞接種于膠上，放入培養(yǎng)箱12 h后，鏡下觀察成管情況并計數(shù)。

吞脂能力檢測：5組細(xì)胞每孔加入Dil-Ac-LDL 5μL，24h后熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞吞脂情況。

資金管理是企業(yè)財務(wù)管理的核心內(nèi)容，而財務(wù)管理又是企業(yè)管理的關(guān)鍵。由于電力企業(yè)生產(chǎn)的特殊性，決定其經(jīng)營目標(biāo)不應(yīng)僅停留在自身利潤的最大化，同時要承擔(dān)一定的社會責(zé)任，保障國民經(jīng)濟(jì)和居民生活對電力能源的需求。就目前發(fā)展?fàn)顩r而言，相較于國民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展速度和居民生活對電力需求的增長速度，我國電力企業(yè)的發(fā)展速度略顯滯后，客觀上就要求電力企業(yè)擴(kuò)大投資建設(shè)力度，加大電力能源供給。而電力企業(yè)生產(chǎn)建設(shè)一般具有資金投入規(guī)模大、固定資產(chǎn)比例高、財務(wù)風(fēng)險大等特點，因此，加強(qiáng)電力企業(yè)資金管理，是推進(jìn)電力企業(yè)良性運作、健康發(fā)展的需要。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)至少重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析，組間比較采用t檢驗，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分離培養(yǎng)LECs的鑒定

免疫磁珠分選法獲取的內(nèi)皮細(xì)胞，細(xì)胞免疫熒光檢測顯示細(xì)胞呈現(xiàn)LECs特異性標(biāo)志物Podoplanin陽性（圖1）；RT-PCR檢測顯示，細(xì)胞特異 性 表 達(dá) Podoplanin、Lyve-1、VEGFR-3、PROX-1（圖 2）；流式分析顯示 Podoplanin陽性率可達(dá)（80.25±0.53）%（圖 3）。

圖1 細(xì)胞免疫熒光檢測結(jié)果（100×）Fig.1 Results of immuno-fluoresence staining(100×)

圖2 RT-PCR 檢測 VEGFR-3、Podoplanin、LYVE-1 和PROX-1的表達(dá)Fig.2 Detection of specific expression of VEGFR-3,Podoplanin,LYVE-1 and PROX-1 in LECs by RT-PCR

圖3 細(xì)胞的流式細(xì)胞儀鑒定Fig.3 Identification of Podoplanin positive cells by flow cytometry

2.2 不同血清濃度培養(yǎng)基培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞檢測

2.2.1 細(xì)胞生長形態(tài)組織學(xué)觀察

細(xì)胞呈鵝卵石樣形態(tài)，無血清組貼壁細(xì)胞數(shù)量較少，其他4組細(xì)胞都呈鋪路石樣排列（圖4）。

圖4 不同濃度血清培養(yǎng)的LECs（40×）Fig.4 Morphology of LECs cultured in different serum concentration(40×)

2.2.2 細(xì)胞增殖情況

無血清組增殖最為緩慢，2.5%組次之，其余各組均在第3～6天進(jìn)入對數(shù)增長期，第6～8天進(jìn)入停滯期。其中7.5%血清組增殖最快數(shù)量最多（圖5）。

圖5 各組LECs的增殖曲線Fig.5 Growth curves of LECs in different goups

成管試驗可見無血清組喪失成管功能，其余各組均保存了成管能力，但是成管數(shù)量差距比較大，各組成管數(shù)分別為：0%組0個、2.5%組3.33±0.58個、5%組 16.00±1.00個、7.5%組 23.33±0.58個、10%組19.33±0.58個，其中7.5%血清濃度組成管能力最好（P<0.05）（圖 6）。

圖6 各組細(xì)胞成管情況（100×）及成管數(shù)Fig.6 Transmission electron microscope analysis for the tube-like structure in matrigel assay(100×)and the bar chart of the tube-like structure number in each group

2.2.4 吞脂試驗

各組細(xì)胞均保持了吞脂能力。表明不同血清濃度對吞脂能力影響不大。

3 討論

淋巴水腫的機(jī)制主要是淋巴管再生障礙導(dǎo)致的淋巴回流障礙，從而造成淋巴液滯留。LECs是淋巴管系統(tǒng)最基本的組成單位，在研究淋巴管發(fā)育和新生的機(jī)制，以及淋巴循環(huán)障礙疾病，甚至腫瘤的淋巴道轉(zhuǎn)移等病理現(xiàn)象時，LECs尤其是微小淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的研究顯得極為重要[9]。相關(guān)研究已有大量報道[9-12]，但是LECs的培養(yǎng)仍然存在很多問題，如不易成活和傳代困難等[10]。近年來，LECs的分離技術(shù)逐漸成熟，但培養(yǎng)方式仍無顯著進(jìn)展，難以獲得足量的有良好活力的LECs。

在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基的選擇具有重要作用，常用的培養(yǎng)基有 DMEM[13]、RPMI-1640[14]、EGM-2[11]等。其中，EGM-2含有 EGF、VEGF等促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長的因子，為完全內(nèi)皮培養(yǎng)基，在內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)中最為常用。本實驗采用EGM-2培養(yǎng)基。

原代LECs培養(yǎng)一般添加20%的胎牛血清，而傳代培養(yǎng)則用10%的胎牛血清[12]。本實驗顯示，不同血清濃度培養(yǎng)的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞主要差別在于增殖能力和成管能力，一定濃度的血清有助于LECs的貼壁、增殖和成管。含7.5%胎牛血清的EGM-2培養(yǎng)時，其增殖曲線最優(yōu)。雖然各組均在第3～6天進(jìn)入對數(shù)增長期，第6～8天進(jìn)入停滯期，但是7.5%血清組的曲線幅度和峰值都明顯高于其他組；7.5%血清組成管能力最強(qiáng)，成管數(shù)量大于其他組（P＜0.05），提示一定濃度的血清對于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的旁分泌促發(fā)成管機(jī)制有一定的促進(jìn)作用，7.5%的血清對成管機(jī)制的促進(jìn)作用最明顯。但其具體的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步探究?？赡艿臋C(jī)制是內(nèi)皮細(xì)胞旁分泌促發(fā)成管，血清濃度影響一些促發(fā)成管因子分泌的變化，不適宜的血清濃度引起促成管因子的減少或抑制成管因子的增加，從而影響成管能力。

本實驗研究了不同血清濃度在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)中的作用，結(jié)果提示7.5%的血清濃度可使在培養(yǎng)過程中保持較好的增殖能力以及特有功能，從而能夠獲得數(shù)量多、功能好的LECs。本實驗對傳統(tǒng)的LECs的培養(yǎng)進(jìn)行了改進(jìn)，完善了LECs培養(yǎng)體系。

[1]Reis-Filho JS,Schmitt FC.Lymphangiogenesis in tumors:what do we know[J]?Microsc Res Tech,2003,60(2):171-180.

[2]Tammela T,Petrova TV,Alitalo K.Molecular lymphangiogenesis:new players[J].Trends Cell Biol,2005,15(8):434-441.

[3]Hu X,Jiang Z,Liu N.A novel approach for harvesting lymphatic endothelial cells from human foreskin dermis[J].Lympha Res Biol,2006,4(4):15-22.

[4]Banerji S,Ni J,Wang SX,et al.LYVE-1,a new homologue of the CD44 glycoprotein,is a lymph-specific receptor for hyaluronan[J].J Cell Biol,1999,144(4):789-801.

[5]Partanen TA,Paavonen K.Lymphatic versus blood vascular endothelial growth factors and receptors in humans[J].Microsc Res Tech,2001,55(2):108-121.

[6]Lymboussaki A,Partanen TA,Olofsson B,et al.Expression of the vascular endothelial growth factor C receptor VEGFR-3 in lymphatic endothelium of the skin and in vascular tumors[J].Am J Pathol,1998,153(2):395-403.

[7]Wilting J,Papoutsi M,Christ B,et al.The transcription factor Prox-l is a marker for lymphatic endothelial cells in normal and diseased human tissues[J].FASEB J,2002,16(10):1271-1273.

[8]戴婷婷,蔣朝華,周廣東,等.淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞與PGA的相容性研究[J],組織工程與重建外科,2010,6(2):75-77.

[9]蔣朝華,胡學(xué)慶,劉寧飛.人真皮淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的分離及冷凍保存[J].上海交通大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2007,27(9):1092-1095.

[10]蔣朝華,胡學(xué)慶,劉寧飛.人真皮來源淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的流式細(xì)胞儀分選和生物學(xué)特點[J].組織工程與重建外科,2009,5(5):267-271.

[11]Lee JY,Park C,Cho YP,et al.Podoplanin-expressing cells derived from bone marrow play a crucial role in postnatal lymphatic neovascularization[J].Circulation,2010,122(14):1413-1425.

[12]田東,付茂勇.體外分離培養(yǎng)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的研究進(jìn)展[J].解剖學(xué)研究,2010,32(2):138-141.

[13]Zeng Y,Opeskin K,Goad J,et al.Tumor-induced activation of lymphatic endothelial cells via vascular endothelial growth factor receptor-2 is critical for prostate cancer lymphatic metastasis[J].Cancer Res,2006,66(19):9566-9575.

[14]Zhuang Z,Jian P,Longjiang L,et al.Identification of oral cancer cell-induced changes in gene expression profile of lymphatic endothelial cell[J].Cancer Invest,2008,26(10):1002-1007.