響應(yīng)面分析優(yōu)化酶法提取南瓜籽油的工藝研究

胡煒東，鄒 寅

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭014109)

南瓜籽又稱白瓜籽、金瓜籽，是葫蘆科植物南瓜的成熟種子，含有豐富的必需脂肪酸、氨基酸、植物甾醇、蛋白質(zhì)、維生素和多糖等，營養(yǎng)非常豐富，在我國種植范圍廣、種類多，資源豐富，極具開發(fā)價值。南瓜籽同時也是具有廣闊開發(fā)應(yīng)用前景的營養(yǎng)保健油源。南瓜籽中油脂含量較高，可占干質(zhì)量的35%～50%，其中亞油酸38.60%、油酸28.63%、棕櫚酸16.55%、硬脂酸8.42%。南瓜籽油不僅能明顯降低血清膽固醇和甘油三酯，而且還能驅(qū)除寄生蟲和防止前列腺疾?。?-2］。目前，南瓜籽油的提取方法有索氏提取法［3］、超臨界流體萃取法［4］、壓榨法［5］、酶法［6］和超聲波法［7］。由于酶的反應(yīng)條件溫和，既可以保持油的有效成分，獲得優(yōu)質(zhì)的南瓜籽油，又可以保持蛋白質(zhì)和其他成分的性質(zhì)，使其進一步被加工利用［8］。本研究采用酶法提取南瓜籽油，以用酶量、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度與提取率為指標，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，利用Box-Benhnken的中心組合設(shè)計原理及響應(yīng)面分析法，確定最佳提油工藝參數(shù)。為南瓜籽油的提取提供新的有效途徑，為生產(chǎn)實踐進一步服務(wù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南瓜籽 內(nèi)蒙古河套地區(qū)籽用裸殼南瓜籽(水分含量5.7%，蛋白35.64%，纖維含量14.32%，可溶性還原糖35.63mg/100g);纖維素酶(活力為35000U/g)上海銳谷生物有限公司;所用試劑均為分析純 內(nèi)蒙鴻日公司。

TCL-16GB高速臺式離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠;LK-600B萬能粉碎機 上海新諾儀器設(shè)備有限公司;索氏提取器 上海魯碩實業(yè)有限公司;RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化廠;JA2003電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 南瓜籽油含量的測定［9］采用索氏提取法(GB/T5009.6-2003)。

1.2.2 纖維素酶輔助提取南瓜籽油的工藝［10-11］

南瓜籽→預(yù)處理→粉碎→稱量→酶解→有機溶劑萃取→離心分離→真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→粗油→恒重→稱量

1.2.3 纖維素酶輔助提取南瓜籽油實驗步驟 將南瓜籽從瓜囊中摘出，洗凈后，烘干至恒重，粉碎，過60目篩，準確稱取50g，按固液比1∶4加入檸檬酸緩沖液，調(diào)節(jié)pH4.8，水浴5min，加入纖維素酶，攪拌，酶解后加入石油醚提取30min，作用完畢以8000r/min離心30min，對油相進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，所得粗油干燥稱重，計算提取率，4℃保存。

1.2.4 單因素實驗 通過單因素實驗，確定p H在4.6～5.0范圍內(nèi)南瓜籽油的提取率達到最大，而在此范圍內(nèi)pH對南瓜籽油提取率的影響差異非常小，因此選用纖維素酶的最適pH4.8為宜;當(dāng)固液比(物料∶檸檬酸緩沖液)達1∶4時，增加固液比對南瓜籽油的提取率增加緩慢，從工藝角度考慮，按固液比1∶4加入檸檬酸緩沖液最佳。進一步選取對酶法提油工藝有顯著影響的三個因素，即用酶量、酶解時間和酶解溫度，按照上述方法對南瓜籽油進行提取實驗，并計算提取率。

1.2.5 纖維素酶輔助提取南瓜籽油實驗設(shè)計 在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用Box-Benhnken的中心組合設(shè)計原理，三個主要因素用酶量(mg/g)、酶解時間(h)、酶解溫度(℃)，分別用 X1、X2、X3來表示，每一個自變量的低、中、高實驗水平分別以-1、0、+1進行編碼，實驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面分析實驗因素水平與編碼表Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.2.6 南瓜籽油提油率計算

式中:W提取油為提取出南瓜籽油的質(zhì)量;W原料為南瓜籽粉末的質(zhì)量;α為南瓜籽含油率。

2 結(jié)果與分析

2.1 索氏提取法測定南瓜籽含油量

重復(fù)3次索氏提取實驗，測得南瓜籽油含量為43.05%。南瓜籽含油量顯著大于玉米胚芽油和大豆油［12］。

2.2 單因素實驗結(jié)果與分析

2.2.1 用酶量對提取效果的影響 固定反應(yīng)溫度45℃，反應(yīng)時間 2h，設(shè)定用酶量 5、10、15、20、25mg/g，考察用酶量對南瓜籽油得率的影響。得到用酶量與南瓜籽油提取率的關(guān)系如圖1所示。

圖1 用酶量對南瓜籽油提取率的影響Fig.1 Effect of cellulose concentration on pumpkin seed oil extraction rate

由圖1可知，隨著酶濃度的增加，南瓜籽油的提取率也在逐漸增大，當(dāng)加酶量大于15mg/g時，油提取率趨于穩(wěn)定，考慮到酶的成本及油的提取效果，宜將酶的添加量確定為15mg/g。

2.2.2 反應(yīng)時間對提取效果的影響 固定用酶量為10mg/g，反應(yīng)溫度45℃，設(shè)定酶解時間 1、1.5、2、2.5、3、3.5h，考察時間對南瓜籽油得率的影響。得到酶解時間與南瓜籽油提取率的關(guān)系如圖2所示。

圖2 酶解時間對南瓜籽油提取率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis time on pumpkin seed oil extraction rate

由圖2可知，隨著酶解時間的延長，南瓜籽油提取率也隨之增加，當(dāng)酶解時間超過2.5h后提取率略有下降，考慮到實際生產(chǎn)需要，酶解時間以2.5h為宜。

2.2.3 反應(yīng)溫度對提取效果的影響 固定用酶量為10mg/g，反應(yīng)時間 2h，設(shè)定酶解溫度 35、40、45、50、55、60℃，考察溫度對南瓜籽油得率的影響。得到酶解溫度與南瓜籽油提取率的關(guān)系如圖3所示。

圖3 酶解溫度對南瓜籽油提取率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on pumpkin seed oil extraction rate

由圖3可知，酶解溫度達45℃時南瓜籽油提取率最高為80.54%，但在40～50℃范圍內(nèi)提取率差異不大，在實際生產(chǎn)中，可根據(jù)實際生產(chǎn)條件選擇45℃左右溫度為宜。

2.3 響應(yīng)面實驗結(jié)果分析

2.3.1 實驗結(jié)果 Box-Benhnken三因素三水平實驗所得南瓜籽油提取率見表2，模型共設(shè)15個實驗，其中1～12號實驗為析因?qū)嶒灒?3～15號為中心實驗。析因?qū)嶒灅?gòu)成三維定點，中心實驗為區(qū)域的中心，重復(fù)三次中心實驗以估計誤差。

2.3.2 模型建立 利用Design-Expert 8.0.6軟件對實驗結(jié)果進行多元擬合，得到用酶量(X1)、酶解時間(X2)、酶解溫度(X3)二次多項回歸方程:Y=88.96667+2.48000X1+0.88375X2+2.19375X3+1.80500X1X2+ 0.05500X1X3+ 0.92750X2X3-4.30708X12-3.35458X22-3.87958X32

2.3.3 方差分析 利用Design-Expert 8.0.6軟件對實驗結(jié)果進行多元回歸分析，結(jié)果見表3，方差分析表明，以南瓜籽油提取率為響應(yīng)值建立的回歸模型是顯著的，而誤差項不顯著，說明回歸方程與實際情況吻合度較好，確定系數(shù) R2=98.91%，R2Adj=96.94%。因此，可用該模型回歸方程代替真實實驗點對實驗結(jié)果進行分析。而且模型中一次項、二次項的影響是顯著的，表明各因素對油提取率的影響是非線性關(guān)系。影響南瓜籽提取率的因素按主次順序排列:用酶量(X1)＞酶解溫度(X3)＞酶解時間(X2)。

2.3.4 響應(yīng)面分析 根據(jù)回歸分析結(jié)果做出相應(yīng)的響應(yīng)面分析圖，由圖4～圖6可以看出存在極值的地方應(yīng)該在等值線圖的圓心，用酶量(X1)對南瓜籽油提取率影響最大，表現(xiàn)為曲線較陡;酶解溫度(X3)、酶解時間(X2)次之，表現(xiàn)為曲線較平滑，隨其數(shù)值的變化，響應(yīng)值變化較小，從圖5可以看出，響應(yīng)面曲線較陡，說明用酶量(X1)和酶解溫度(X3)對南瓜籽油提取率的影響較明顯，這與方差分析的結(jié)果相一致。由圖4～圖6中等高線的形狀可以反映出交互效應(yīng)的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形表示相反，圖4等高線可以看出，用酶量(X1)與酶解時間(X2)交互作用對南瓜籽油的提取率影響顯著，表現(xiàn)為等高線呈橢圓形，酶解時間(X2)和酶解溫度(X3)交互作用次之，由圖5可知，用酶量(X1)與酶解溫度(X3)之間交互作用最小，表現(xiàn)為響應(yīng)面曲線間差異小，等高線最接近于圓形。

表3 回歸分析結(jié)果Table 3 Analysis results of regression and variance

圖4 用酶量與酶解時間對南瓜籽油提取率影響的響應(yīng)曲面圖Fig.4 Response surface of cellulose concentration and hydrolysis time on the extraction rate of oil

為了確定各因素的最優(yōu)值，利用軟件分析得X1、X2、X3的最大代碼值 0.346、0.269 和 0.317，換算得出實際值為用酶量(X1)16.73mg/g，酶解時間(X2)為2.6345h，酶解溫度(X3)為46.585℃，理論提取率為89.86%。

2.3.5 回歸模型的驗證實驗 為檢驗響應(yīng)面分析所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化條件進行提取南瓜籽油實驗，考慮到實際操作，將提取條件修正為用酶量17mg/g，酶解時間為2.64h，酶解溫度為47℃，在此條件下提取3次，南瓜籽油平均提取率89.12%，實驗值與理論值的相對誤差為0.82%。由此可見該模型很好的反映了酶法提取南瓜籽油的條件，證明利用響應(yīng)面法確立酶法提取南瓜籽油的工藝參數(shù)是可行的。

圖5 用酶量與酶解溫度對南瓜籽油提取率影響的響應(yīng)曲面圖Fig.5 Response surface of cellulose concentration and hydrolysis temperature on the extraction rate of oil

圖6 酶解時間與酶解溫度對南瓜籽油提取率影響的響應(yīng)曲面圖Fig.6 Response surface of hydrolysis time and hydrolysis temperature on the extraction rate of oil

3 結(jié)論

利用輔助酶法提取南瓜籽油，具有高效、溫和、經(jīng)濟等特點，同時采用Box-Benhnken中心組合設(shè)計原理及響應(yīng)面分析法，利用Design-Expert軟件進行便捷、可靠的優(yōu)化組合和數(shù)據(jù)分析，得出纖維素酶提取南瓜籽油的較佳工藝:用酶量17mg/g，酶解時間為2.64h，酶解溫度為47℃，南瓜籽油提取率達89.12%。與理論預(yù)期值的擬合度較好。各因素主次關(guān)系為:用酶量(X1)＞酶解溫度(X3)＞酶解時間(X2)。

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