超聲輔助半仿生法提取半邊蓮黃酮苷及抗氧化性研究

黃秀香，韋漢龍，盤玉芬

(河池學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系，廣西宜州546300)

半邊蓮(Lerba Lobelia Chinensis)為桔?？浦参锇脒吷彽膸Ц?，半邊蓮含生物堿、黃酮苷、皂苷、氨基酸、果聚糖等成分，具有利水、消腫、解毒等功效，可治療黃疸、水腫、臌脹、泄瀉、痢疾、蛇傷、疔瘡、腫毒、濕疹、癬疾、跌打扭傷等癥［1］。超聲波具有加速藥材中有效成分溶解、縮短提取時間、提高有效成分的提取率等優(yōu)點［2］。半仿生提取法是從生物藥劑學(xué)的角度將整體藥物研究法與分子藥物研究法相結(jié)合，模仿口服藥物在胃腸道的轉(zhuǎn)運過程，采用選定p H的酸性水和堿性水，依次連續(xù)提取得到含指標(biāo)成分高的活性混合物的中藥和方劑的藥效物質(zhì)提取的方法［3］。論文采用超聲波協(xié)同半仿生法對半邊蓮黃酮苷提取工藝進行優(yōu)化及抗氧化性研究，為半邊蓮的藥物及抗氧化作用研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

半邊蓮 購自宜州市中藥市場，產(chǎn)地廣西宜州;蘆丁對照品 中國藥品生物制品檢定所，純度98%;無水乙醇、氫氧化鈉、九水合硝酸鋁、亞硝酸鈉、石油醚(60～90℃)、醋酸鉛、三氯化鋁、碳酸鈉、濃鹽酸、磷酸氫二鈉、檸檬酸、硫酸亞鐵、三羥基氨基甲烷、鄰苯三酚、磷酸鹽緩沖液、水楊酸、活性炭、H2O2、抗壞血酸、鎂粉、堿式醋酸鉛 均為分析純。

UV-2501紫外分光光度計 日本島津公司;AR224CN型電子分析天平 奧豪斯儀器有型公司;KQ2200DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;FW100型高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司;PHS-25型數(shù)顯pH計 上海精密科學(xué)儀器有限公司;SHB-III循環(huán)水式多用真空泵鄭州長城科工貿(mào)有限公司;低速臺式大容量離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 半邊蓮預(yù)處理 將干燥的半邊蓮粉碎，過40目篩后得到半邊蓮粉末，取100g半邊蓮粉末加入400m L石油醚(60～90℃)脫脂2h，抽濾，放置自然風(fēng)干得到脫脂樣品作為后續(xù)提取工藝的樣品。

1.2.2 黃酮苷的提取方法 準(zhǔn)確稱取該樣品1.0000g，用乙醇水溶液作為提取劑，模擬胃腸道pH進行提取。用磷酸氫二鈉-檸檬酸的緩沖溶液-鹽酸調(diào)pH，在40℃下，設(shè)定料液比及不同的超聲功率和超聲時間，改變?nèi)芤?pH 分別為2、7.5，提?。?］。合并兩次提取液，加活性炭脫色，抽濾，用同濃度的乙醇定容，待測。

1.2.3 黃酮苷的含量測定［5］精確稱取10.3000mg蘆丁，置于燒杯中完全溶解，轉(zhuǎn)移至100m L的容量瓶中，用60%乙醇定容。取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0m L于10m L的具塞比色管中，分別加入5%NaNO2溶液0.3m L，搖勻，放置6m in后，分別加入濃度10%Al(NO3)3溶液0.3m L，搖勻，再放置6m in后，再分別加入10%NaOH溶液4m L，用60%的乙醇定容到10m L刻度，搖勻，放置10m in后，采用空白試劑參比，在510nm處測吸光度，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。精確吸取待測樣液1m L于10m L具塞比色管中，按此方法測其吸光度，計算其含量。

黃酮苷含量=C×V1×V2/(m×V3)

式中:C-蘆丁標(biāo)準(zhǔn)濃度mg/m L;V1-稀釋的體積m L;V2-定容的體積m L;V3-取樣體積m L。

1.2.4 黃酮苷的還原力測定［6］取5支10m L具塞比色管，分別加入不同質(zhì)量濃度半邊蓮提取液1m L，再加入2.5m L(pH6.6)0.2mol/L磷酸緩沖液及2.5m L含1%鐵氰化鉀溶液，50℃水浴20m in后急速冷卻，加入含2.5m L 10%三氯乙酸水溶液，離心，取上清液2.5m L，加2.0m L蒸餾水及0.5m L含0.1%三氯化鐵溶液，混勻，靜置10m in后在700nm處測定吸光度。以蒸餾水作參比，VC為陽性對照。

1.2.5 黃酮苷清除羥自由基的測定［7］取6支10m L具塞比色管編號，分別加入2mmol/L FeSO4溶液2m L，6mmol/L水楊酸溶液2m L，已知質(zhì)量濃度的黃酮苷提取液 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0m L，加 1mmol/L H2O22m L，定容至10m L，搖勻后，于37℃水浴中加熱15m in后取出，以蒸餾水為參比，在510nm處測吸光度(A1)。每個處理重復(fù)3次。同時用蒸餾水代替雙氧水時測得本底吸收吸光度A2。以蒸餾水作參比，VC為陽性對照。

清除率(%)=［A0-(A1-A2)］/A0×100

式中:A0-空白對照液吸光度;A1-樣品液吸光度;A2-不加H2O2的樣品液的吸光度。

1.2.6 黃酮苷清除超氧自由基的測定［7］取6支10m L具塞比色管，分別加入 Tris-HCl緩沖液(50mmol/L，pH8.2)4.5m L、蒸餾水 2.2m L，置于 25℃水浴中保溫20min;1號為空白管加入10mmol/L HCl 0.3m L、蒸餾水2m L，其余5支試管分別加入25mmol/L的鄰苯三酚溶液0.3m L(以10mmol/L HCl配制)、不同濃度的提取液2m L，混勻后于25℃水浴中反應(yīng)5m in。以Tris-HCl緩沖液作參比，在320nm處測定吸光度，計算清除率。重復(fù)三次實驗，取平均值。以蒸餾水作參比，VC為陽性對照。

式中:A0-空白的平均吸光度;A1-試樣的平均吸光度。

1.2.7 超聲波輔助半仿生法提取半邊蓮黃酮苷工藝條件優(yōu)選 影響黃酮苷含量的主要因素:乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲功率、超聲時間。

通過單因素實驗，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%～80%，料液比為 1∶20～1∶40，超聲功率在 60～80W 之間，超聲時間為20～30min。采用L9(34)正交實驗方案，實驗因素水平設(shè)計方案見表1。

表1 正交實驗因素及水平Tabel1 Factors and levels in orthogonal array design

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

按照蘆丁對照品濃度梯度與對應(yīng)的吸光度繪制標(biāo)校準(zhǔn)曲線，得回歸方程:A=7.8225C+0.0054，R2=0.9993，式中:A為吸光度值，C為蘆丁的濃度(mg/mL)。

2.2 黃酮苷的鑒別

鹽酸-鎂粉實驗:取乙醇提取液1m L，加入濃鹽酸4～5滴及少許鎂粉，在沸水浴上加熱3m in，呈現(xiàn)紅色，表明有游離黃酮類或其苷類。

醋酸鉛沉淀實驗:取乙醇提取液2m L，滴加醋酸鉛飽和溶液，有黃色沉淀，繼續(xù)加至無沉淀時離心取其上層清液，再用堿式醋酸鉛實驗，觀察有黃色沉淀產(chǎn)生。實驗兩次都有黃色沉淀產(chǎn)生，說明有游離黃酮類或其苷類。

2.3 半邊蓮黃酮苷提取最佳工藝條件及極差分析

超聲波輔助半仿生法提取半邊蓮黃酮苷正交實驗結(jié)果及極差分析，見表2。

表2 正交實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Orthogonal array designmatrix and experimental results

從表2可以看出，各因素對提取效果影響的主次順序為料液比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞超聲時間＞超聲功率。最佳提取條件為A2B3C2D2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，料液比1∶40，在40℃超聲功率為70W下，超聲時間25min。通過驗證實驗，測得黃酮苷的含量為4.6975mg/g。

2.4 黃酮苷還原力作用

由圖1可知，在28～140μg/g范圍內(nèi)，隨著黃酮苷、VC質(zhì)量濃度的增大，還原力逐漸增強，當(dāng)質(zhì)量濃度為56μg/g，黃酮苷吸光度為0.294，VC吸光度為0.32，證明半邊蓮中黃酮苷在一定的濃度范圍內(nèi)有較好的還原能力，但比VC稍差。

圖1 半邊蓮黃酮苷的還原力Fig.1 Reducing power of flavonoid glycoside from Herba Lobelia Chinensis

2.5 黃酮苷羥自由基的清除作用

由圖2可以看出，半邊蓮黃酮苷對羥自由基的清除能力在一定的濃度范圍內(nèi)隨著黃酮苷質(zhì)量濃度的增加而增強，具有一定的量效關(guān)系。半邊蓮黃酮苷對羥自由基的 IC50為 42.2μg/g，VC的 IC50為35.6μg/g，半邊蓮黃酮苷對羥自由基的清除能力小于VC。

圖2 半邊蓮黃酮苷對羥自由基的清除作用Fig.2 Hydroxyl radical scavenging effect of flavonoid glycoside from Herba Lobelia Chinensis

2.6 黃酮苷超氧自由基的清除作用

由圖3可以看出，半邊蓮黃酮苷對超氧基自由基有明顯的清除作用，在0.5～2.5μg/g隨著濃度的增加，其對超氧自由基的清除能力增強，即兩者之間存在量效關(guān)系。半邊蓮黃酮苷對超氧自由基的IC50為1.4μg/g，VC的 IC50為 1.3μg/g，半邊蓮黃酮苷對超氧自由基的清除能力略低于VC。

圖3 半邊蓮黃酮苷對超氧自由基的清除作用Fig.3 Superoxide anion radical scavenging effect of flavonoid glycoside from Herba Lobelia Chinensis

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，以磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液為提取液，運用仿生法原理對半邊蓮黃酮苷進行超聲波輔助提取是可行的。因為半仿生法可以提取和保留更多的有效成分，得到含藥理指標(biāo)高的活性混合成分［8］，而超聲輔助能夠提高提取效率、省時，是一種行之有效的提取方法。通過正交實驗得出:在此方法作用下提取半邊蓮中黃酮苷的最佳工藝條件為體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，料液比1∶40，在40℃超聲功率為70W下，超聲提取25min，測得黃酮苷含量為4.6975mg/g。

通過對羥自由基和超氧陰離子自由基清除作用的研究發(fā)現(xiàn)，半邊蓮黃酮苷對這兩種自由基的清除作用隨著濃度的增加而增大，呈明顯的量效關(guān)系，具有一定的清除作用，在實驗所選濃度范圍內(nèi)，還原能力隨濃度增加而增強，是一種天然有效的抗氧化劑。

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