金屬硫蛋白對鯉魚不同組織重金屬蓄積影響的研究

邵欣欣，許曉曦，* ，呂萍萍，李 華，高繼銘

(1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030;2.綏芬河出入境檢驗檢疫局，黑龍江綏芬河157300)

隨著工業(yè)化發(fā)展的不斷加快，工業(yè)廢水大量排放到自然水體中，其中所含的重金屬離子，如銅(Cu)、汞(Hg)、鎘(Cd)、鉛(Pb)和砷(As)等，對水體污染極為嚴重。重金屬的毒作用主要是妨礙人體必需微量元素的吸收，干擾巰基功能從而影響酶和蛋白的活性，具有急性毒性和累積毒性以及遠期毒效應，長期食用高重金屬含量的食物容易引起神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)和消化系統(tǒng)多臟器損害［1-3］。魚體內(nèi)重金屬的蓄積與魚的種類、大小、健康狀況以及環(huán)境污染構(gòu)成和嚴重程度有關(guān)，水體中的重金屬污染物可通過食物鏈傳遞進入人體并對人類造成嚴重的危害［4］。Maiti和 Banerjee［5］認為，水生生物體內(nèi)的重金屬主要是通過食物網(wǎng)積累而得的。由于重金屬具有持久性特征，可經(jīng)沉積物吸附、生物富集及食物鏈逐級放大，即使微量污染都會產(chǎn)生嚴重的負面影響。因此重金屬在魚體內(nèi)的積累、排放及其毒性效應研究一直受到人們的高度重視。金屬硫蛋白(Metallothionein，簡稱MT)是一類低分子量、富含半胱氨酸能大量結(jié)合金屬離子的蛋白質(zhì)［6］，MT的巰基基因(-SH)能強烈螯合有毒金屬汞、銀、鉛、鎘、砷、鉻、鎳、銅等，并可將之排出體外，起到解除重金屬對生物毒性的作用，這對保護大腦、肝、腎等重要器官具有極其重要的意義。動物實驗表明，對水源造成污染的重金屬多數(shù)能誘導水生生物體內(nèi)尤以肝臟、腎臟等組織內(nèi)金屬硫蛋白的生物合成增加。由于魚體內(nèi)的MT與水環(huán)境和體內(nèi)組織中的重金屬之間有顯著的相關(guān)性，因而MT可以作為重金屬暴露的生物標志物［7］，為水產(chǎn)品的清潔管理及利用水生生物體內(nèi)MT含量評價水體質(zhì)量，確定水環(huán)境污染程度提供綜合和客觀的指標［8］。本文采用室內(nèi)半靜態(tài)法將鯉魚暴露于 Cu2+(0.2mg/L)、Hg2+(0.01mg/L)質(zhì)量濃度溶液中，研究銅、汞在鯉魚幼魚主要組織器官—肝臟、腎臟、肌肉及腮中的積累量隨暴露時間的變化特征，并且對魚體的幾種組織器官的MT做了定量分析，進一步研究了隨著暴露時間推移魚體金屬硫蛋白的含量和組織中銅、汞濃度的關(guān)系，為魚體自身對外界污染水體毒物的積累和凈化機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鯉魚(Cyprinus carpio) 當?shù)厥袌鲑徺I，平均體長(13.4±0.4)cm，平均體重(48.1±0.5)g，經(jīng)曝氣3d的自來水中暫養(yǎng)兩周，對實驗室的環(huán)境適應良好，自然死亡率極低，然后選取體表無傷，身體健康的個體供實驗所用。研究器官:肝臟，腎臟，肌肉，鰓;HgCl2、CuSO4·5H2O、HNO3(濃)、HClO4、HCl、三羥甲基氨基甲烷(簡稱Tris)、CHCl3和無水乙醇(95%)等試劑均為分析純;硝酸+高氯酸混合酸(4∶1)，牛血清白蛋白，HRP-羊抗兔IgG，兔抗魚MT多克隆抗體(本實驗制備)等。

PE-800型原子吸收分光光度計 美國珀金埃爾默公司;DMA-80測汞儀 萊伯泰科有限公司;PHS-3C型pH計 上海精密科學儀器有限公司;TGL18M臺式高速冷凍離心機 鹽城市凱特實驗儀器有限公司;可調(diào)試恒溫電熱板、可調(diào)試電爐 上海特成機械設備有限公司;101C-1B型電熱鼓風干燥箱 金華雷琪實驗器材有限公司;電子分析天平、溫度計 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;酶標板(NUNC，F(xiàn)16)、酶標儀 杭州生友生物技術(shù)有限公司;勻漿機 南京萊步科技實業(yè)有限公司;磁力攪拌器 鄭州南北儀器設備有限公司;電熱恒溫水浴鍋北京東方精瑞公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗魚暴露處理方法 本實驗用水為曝氣3d以上的自來水，自來水中未檢出 Cu2+、Hg2+，溶氧(DO)大于7mg/L，實驗期間水溫為20～25℃，p H6.8～7.4，并用增氧機保證水體的溶解氧，同時保持自然光照。養(yǎng)殖金屬離子的濃度，分別選取國家漁業(yè)水質(zhì)標準Cu2+(0.01mg/L)、Hg2+(0.0005mg/L)的20倍Cu2+(0.2mg/L)、Hg2+(0.01mg/L)，對照組 Cu2+(0.00mg/L)、Hg2+(0.00mg/L)。

實驗前，養(yǎng)殖水族箱的均需以硝酸溶液(20%)浸泡過夜后，再用現(xiàn)配的等濃度的金屬液進行處理(消除原水族箱可能含有的實驗金屬離子以及消除器壁對金屬離子的吸附影響)，所用的玻璃儀器等工具均用HNO3(1+5)浸泡24h以上，用水反復沖洗，最后用去離子水反復沖洗干凈，備用。

1.2.2 重金屬在鯉魚組織中的蓄積 蓄積時間為3周，每3d在同一時間取樣一次。為保持養(yǎng)殖環(huán)境的一致性，實驗期間每天正常喂食，半靜態(tài)換水(每天更換三分之一的水)，同時加進含有相同濃度重金屬的等體積的水溶液，及時清理水體雜質(zhì)及排泄物，并補充蒸發(fā)等喪失的水，以免影響重金屬離子的濃度。

取樣，每次隨機從每組中取5尾，用去離子水清洗表面，用干毛巾查干魚體，解剖取肝臟、腎臟、肌肉和腮組織，用濕法進行消解，同時作試劑和對照組空白實驗，利用原子吸收光譜儀和測汞儀分別測定銅和汞含量。

1.2.3 金屬硫蛋白的提取和檢測 取鯉魚的肝臟、腎臟、肌肉、鰓稱重后按鮮重1∶4(重量體積比)加入含有0.25mol/L蔗糖的0.1mol/L pH8.6的Tris-HCl緩沖液。勻漿后，取0.25mL上清液加入0.2mL蒸餾水，充分混勻后再加入0.1mL血紅蛋白(9%)。80℃加熱5min，冷卻后離心，轉(zhuǎn)速為10000r/min，20min;又將加入血紅蛋白，離心過程再重復3次。最后取上清液1.0mL加入0.5mL蒸餾水，用原子吸收光譜儀和測汞儀分別測銅和汞的濃度，然后將其換算成MT含量。

以上述方法制備的鯉魚肝臟和腎臟勻漿后，取上清液以酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)［9］測定MT含量。以包被液按1∶100稀釋后，加100μL于酶標板的凹孔中，加蓋4℃過夜，以p H7.4 Tris-HCl(內(nèi)含質(zhì)量分數(shù)為0.05%Tween-20)緩沖液洗滌3次;加入封閉液(質(zhì)量分數(shù)1.5%牛血清白蛋白)200μL，37℃，1h后洗滌 3次;加入 100μL兔抗魚 MT多克隆抗體(1∶1000 倍)37℃，2h，以緩沖液洗滌3 次，將 HRP-羊抗兔IgG抗體(1∶1000稀釋)100μL加入孔內(nèi)，37℃，1.5h，以緩沖液洗滌3次，蒸餾水洗滌3次，孔內(nèi)加入100μL TMB應用液，室溫放置 15min后，再加入50μL 2mol/L H2SO4，5min 后測 A450。

數(shù)據(jù)處理采用Excel7.0版及SPSS數(shù)據(jù)分析軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 重金屬在魚體組織的積累和分布狀況

實驗測定了隨著蓄積時間暴露于Cu2+(0.2mg/L)和Hg2+(0.01mg/L)在鯉魚幼魚的肝臟、腎臟、肌肉、鰓內(nèi)的積累和分布見表1、表2。

當鯉魚暴露于含 Cu2+(0.2mg/L)和 Hg2+(0.01mg/L)染毒液后，隨著時間的推移肝臟、腎臟、肌肉和腮中的銅、汞濃度一直呈波動上升趨勢，腎中銅濃度先上升后下降，而汞濃度則一直保持上升趨勢。不同組織中濃度上升的幅度有明顯的差異(p≤0.05)。表明Cu2+、Hg2+在鯉魚組織中的積累是很快的，尤其是肝臟和腎臟對Cu2+、Hg2+具有較強的富集能力。在積累的6d后肝臟和腎臟上升趨勢明顯減緩，肌肉和腮呈現(xiàn)出上下波動狀態(tài)，但整體處于上升趨勢，肝臟和腎臟中Cu2+、Hg2+上升幅度最大，其次是鰓，最小的為肌肉，且與對照差異顯著(p≤0.05)。

魚體組織暴露6～21d間趨于平緩增加趨勢，主要是由于鰓的特殊結(jié)構(gòu)有利于水中離子穿過，鰓成為魚體直接從水中吸收重金屬的主要部位。因為內(nèi)臟，尤其是肝有解毒作用，組織內(nèi)可誘導產(chǎn)生大量束縛重金屬的金屬硫蛋白，使肝成為魚體內(nèi)蓄積重金屬的主要部位。相比之下，肌肉對重金屬的親和性遠比上述器官、組織弱，蓄積量相對較少?？梢?，在相同條件下，鯉魚的組織整體對Cu的蓄積能力都比對Hg強，同種魚的不同組織對不同重金屬的蓄積能力是不一樣的。

2.2 金屬硫蛋白在魚體組織的含量和變化

鯉魚(以5條魚平行實驗)暴露于Cu2+(0.2mg/L)和Hg2+(0.01mg/L)環(huán)境中，隨時間的變化肝臟，腎臟，肌肉，鰓內(nèi)MT含量分布如圖1、圖2，其結(jié)果表明MT含量在各組織中差異很大，尤其在肝臟，腎臟內(nèi)含量明顯突出。因此，與其他組織器官相比，肝臟和腎臟是吸收重金屬銅、汞最強的組織器官。在受污染的水環(huán)境中，魚的肝臟、腎臟等部位MT含量較高［10］，反映了在金屬誘導下，MT合成在肝臟和腎臟旺盛，是絡合和積累金屬的主要器官。因此，以魚體內(nèi)肝臟和腎臟作為重金屬污染的指示器官，用MT含量來檢測和評估重金屬對魚體和水體質(zhì)量的影響，與其他方法相比，能夠表現(xiàn)混合污染物之間毒性相互作用的累積效應。

表1 Cu在鯉魚不同組織中的含量(mg/g濕重)Table1 ThecontentofCuincarpsfordifferenttissues(mg/gwetweight)

表2 Hg在鯉魚不同組織中的含量(μg/g濕重)Table2 ThecontentofHgincarpsfordifferenttissues(μg/gwetweight)

圖1 鯉魚各組織臟器MT含量(Cu2+)Fig.1 ThecontentofMTincarpsfordifferenttissues(Cu2+)

2.3 金屬硫蛋白與重金屬蓄積的關(guān)系

水生生物在某種程度上均積累金屬，但積累量視生物種類而異［11-12］。本文所研究的鯉魚組織中，肝臟和腎臟的積累量最多，其次是腮和肌肉。

圖2 鯉魚各組織臟器MT含量(Hg2+)Fig.2 ThecontentofMTincarpsfordifferenttissues(Hg2+)

鯉魚暴露于含銅和汞的染毒液后，肝臟MT明顯升高。MT具有很強的可誘導性，實驗證明動物經(jīng)口或腹腔注射Cu、Hg時，其肝臟、腎臟、腮等器官組織內(nèi)MT的含量增加，能誘導MT合成的金屬較多，例如 Cu、Ag、Cd、Au、Hg、Zn、Ni、Al、Co 等，MT 可以與銅、汞(重金屬)離子配位形成低毒或無毒絡合物，起到消除重金屬的毒害作用。鯉魚暴露在含銅染毒液中第12d時，Cu-MT含量最高，第12d之后，Cu-MT含量明顯下降，在此之前，肝臟MT與肝臟中的銅濃度間存在著正相關(guān)。鯉魚暴露在含汞染毒液中第9d時，Hg-MT含量最高，第9d之后，Hg-MT含量明顯下降。同時發(fā)現(xiàn)，鯉魚暴露在含汞染毒液中第6d后死亡率增加，暴露在含銅染毒液中第9d后死亡率增加。汞對水生生物毒性很大，是污染水域中存在最廣泛、毒性最強的一種金屬毒物。Dethloff等發(fā)現(xiàn)，銅的實際質(zhì)量濃度達到 26.9μg/L時，魚肝 MT的mRNA水平在實驗期間(21d)一直顯著地升高，而且在第3d和第21d達到峰值，而且魚肝MT的mRNA水平與實驗中魚死亡規(guī)律一致［13］。

可見，在金屬誘導過程中，不同的誘導時間、不同的金屬種類誘導效果不相同。Marr［14］研究表明肝MT與肝中的銅濃度間存在著正相關(guān)，Dursu［15］研究表明肝中銅濃度與肝MT的mRNA呈正相關(guān)。說明在一定條件下，生物體內(nèi)金屬硫蛋白的含量與重金屬離子的含量成正比。因此，在受到重金屬離子污染的情況下，生物體通過誘導出大量金屬硫蛋白與重金屬離子結(jié)合而掩蔽重金屬離子的毒性，這是生物體對環(huán)境的一種應激保護性反應，是生物體對周圍環(huán)境過量重金屬的一種防御機制，防御有毒物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的細胞毒素對有機體產(chǎn)生影響［16］。一般來說，監(jiān)測MT的方法可以將細胞內(nèi)具有顯著毒性效應的金屬結(jié)合片斷與不可利用的金屬絡合物區(qū)分開來。因此，金屬硫蛋白含量的測定可以作為水體環(huán)境污染狀況以及水生生物耐受力等具有重要意義。

3 結(jié)論

3.1 本文利用MT作為生物標志物，研究銅、汞在鯉魚幼魚主要組織器官—肝臟、腎臟、肌肉及腮中的積累量隨暴露時間的變化特征，并且進一步探討了鯉魚主要組織對重金屬的積累規(guī)律與金屬硫蛋白的關(guān)系，由實驗結(jié)果看出，在相同條件下魚體不同組織對重金屬積累量會有所不同，魚體積累重金屬的量隨積累時間的延長而增加。在受污染的水環(huán)境中，魚體的肝臟、腎臟是吸收和積累重金屬的主導器官，也是重金屬污染的最適指示器官。為人們選擇水域作為飲用水域、養(yǎng)殖水域等提供了理論依據(jù)。MT作為重金屬污染的生物標志物，為魚體自身對外界污染水體毒物的積累和凈化機制提供參考，對制定預防性管理措施，及時避免和減輕環(huán)境污染具有重要意義，同時為水產(chǎn)品的清潔管理，選擇適宜的養(yǎng)殖魚種提供了科學的依據(jù)。

3.2 本研究采用ELISA法測定魚體MT，可以非常特異地檢測出組織勻漿液中微量的MT，是當前檢測MT最靈敏的方法之一，而血紅蛋白/鎘飽和法雖然方法操作簡便、快速，但此方法有一定的局限性，即不能用于Bi，Hg，Cu-MT的測定，由于這兩種方法具有不同的特點及實驗上的局限性，工作中應根據(jù)具體情況而選擇不同的方法，也可以兩種方法并用，綜合作出評價。

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