應用分子標記檢測作物雜交種純度研究現(xiàn)狀及比較分析

劉子記，曹振木，楊衍

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點開放實驗室，海南儋州，571737）

種子是重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料，是實現(xiàn)農(nóng)業(yè)科技進步的載體。種子質(zhì)量的優(yōu)劣直接影響農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量和優(yōu)良品種的增產(chǎn)潛力，而種子質(zhì)量的好壞在很大程度上取決于種子的純度，開展種子純度檢測對保證種子質(zhì)量和提高生產(chǎn)效益具有重要意義。生物混雜及機械混雜是影響雜交種純度的主要原因，作物雜交種純度檢驗的常用方法主要包括形態(tài)鑒定、田間鑒定和同工酶電泳技術鑒定等[1]。種子形態(tài)差異有限，且易受環(huán)境條件影響，因此形態(tài)鑒定準確性較差；田間鑒定所需時間較長，成本較高，表型易受栽培措施和環(huán)境條件的影響，不同的鑒定者對同一性狀的評價也存在一定的差異，不能滿足快速檢測雜交種純度的需要；同工酶鑒定雖然準確、可靠、不受外界環(huán)境影響，但多態(tài)性不夠豐富，且有組織和器官特異性[2]。

隨著作物新品種數(shù)量的不斷增加，遺傳基礎日趨狹窄，傳統(tǒng)的鑒定方法不能有效區(qū)分遺傳關系較近的雜交種[3]，難以滿足作物雜交種純度鑒定在精確度方面的要求。近年來，隨著DNA分子標記技術的問世及迅速發(fā)展，使得從基因組水平上檢測雜交種純度成為可能。分子標記技術能夠從DNA水平上揭示雜交子代與親本間的遺傳差異，不受植株生長季節(jié)的限制，不受基因表達、栽培條件和環(huán)境條件的影響，無器官、組織及發(fā)育特異性，能夠檢測微小的變異，多態(tài)性豐富，穩(wěn)定性高，可以大大縮短檢驗時間[4]。近年來，分子標記技術在國內(nèi)外被廣泛應用于作物雜交種純度鑒定。

1 RFLP分子標記在鑒定作物雜交種純度中的應用

RFLP （Restriction fragment length polymorphism）分子標記，即限制性片段長度多態(tài)性，其基本原理是利用限制性內(nèi)切酶酶切基因組DNA，酶切后的DNA分子經(jīng)凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜和變性，利用放射性同位素標記的探針與膜上的DNA片段雜交，檢測由堿基的插入、缺失、重排或點突變引起的多態(tài)性，是發(fā)展最早的DNA標記技術。

RFLP標記具有穩(wěn)定可靠、結(jié)果準確、不受植物發(fā)育階段影響等優(yōu)點。Smith等[5]利用RFLP分子標記成功鑒定了78個玉米雜交種品種；Matsuura等[6]研究結(jié)果表明，利用RFLP標記可快速檢測黃瓜雜交種的純度（表1）。但由于RFLP標記操作程序繁瑣、成本較高、多態(tài)性檢出率低、對DNA的需求量大且質(zhì)量要求較高、并且放射性同位素對操作人員身體有害，此法不適于進行大批量雜交種純度鑒定，在實際應用中受到限制。

2 RAPD分子標記在鑒定作物雜交種純度中的應用

RAPD（Random amplified polymorphic DNA）標記，即隨機擴增多態(tài)性DNA，該技術建立在PCR基礎上，以基因組DNA為模板，以10個堿基左右的隨機寡聚核苷酸序列為引物，檢測遺傳位點的多態(tài)性，可對未知序列的基因組進行多態(tài)性分析。該技術具有操作簡便、成本低、自動化程度高、分辨率高、實驗周期短、靈敏度強、檢測位點多、DNA用量少等優(yōu)點，能有效檢測從形態(tài)和生化指標上均無法檢測到的差異，被廣泛用于雜交種純度鑒定、基因定位和基因克隆等多方面研究。RAPD標記被成功應用于苦瓜[7]、冬瓜[8]、南瓜[9]和西瓜[10]等瓜類作物雜交種純度的鑒定；莫結(jié)勝等[11]利用RAPD標記鑒定雜交油葵種子純度，鑒定結(jié)果與大田檢測結(jié)果基本一致；朱海山等[12]和葛菊芬等[13]研究結(jié)果表明，RAPD標記可以用于番茄和辣椒等茄果類作物雜交種純度的鑒定；邵景俠等[14]成功利用RAPD標記對雜交小麥西雜一號進行純度鑒定（表1）。

由于RAPD標記屬于顯性標記，不能有效區(qū)分純合基因型和雜合基因型，另外其穩(wěn)定性和重復性較差，易受各種因素的影響，通常將其轉(zhuǎn)化為SCAR（Sequenced characterized amplified regions）標記，其原理是將多態(tài)性片段回收、克隆、測序后，設計出較長的引物進行特異擴增，可以顯著提高檢測的穩(wěn)定性和實用性。陳靈芝等[15]成功將RAPD標記轉(zhuǎn)化成SCAR標記，有效地將隴椒5號辣椒雜交種與母本區(qū)分開來；王飛等[16]建立了檢測金棚1號番茄雜交種純度的SCAR標記技術體系，為金棚1號番茄種子的生產(chǎn)與銷售提供了有效的檢測方法（表1）。

3 AFLP分子標記在鑒定作物雜交種純度中的應用

AFLP（Amplified fragment length polymorphism）分子標記，即擴增片段長度多態(tài)性，該技術利用限制性內(nèi)切酶酶切基因組DNA，將特定的接頭與酶切后的DNA片段連接，根據(jù)接頭與酶切位點的序列設計PCR引物進行擴增，檢測遺傳位點多態(tài)性。

該技術具有多態(tài)性豐富、重復性高、可靠性好、不需要預先知道基因組序列信息等優(yōu)點。劉杰等[17]試驗結(jié)果證明，利用AFLP標記檢測向日葵雜交種純度是可行的；宋順華等[18]成功利用AFLP技術將90個大白菜品種區(qū)分開來；王玲平等[19]以瓠瓜雜交種浙蒲2號及其父、母本為材料，成功建立了利用AFLP分子標記進行瓠瓜雜交種純度鑒定的技術體系（表1）。但由于操作繁瑣、對試驗技能要求較高，試驗周期較長，對DNA的質(zhì)量要求很高，AFLP技術難以在種子純度鑒定中獲得廣泛應用。

4 SSR分子標記在鑒定作物雜交種純度中的應用

SSR（Simple sequence repeats）標記，即簡單序列重復，是一類由幾個核苷酸為重復單位組成的長達幾十個核苷酸的串聯(lián)重復序列，SSR兩側(cè)的序列一般相對保守，通過設計特異引物進行擴增，根據(jù)串聯(lián)重復單位數(shù)目的差異檢測多態(tài)性。

SSR標記具有數(shù)量豐富、在染色體上分布均勻、多態(tài)性高、共顯性遺傳、等位性變異豐富、重復性好、對DNA質(zhì)量要求不高且需要量少、操作簡單、不受環(huán)境因素影響等優(yōu)點，已在多種農(nóng)作物雜交種純度鑒定中得到應用。蘭剛等[2]、王愛娜等[20]和宋賢勇等[21]分別利用SSR標記對油菜雜交種合油雜2號、秦優(yōu)33和秦優(yōu)11進行純度鑒定，鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果基本一致；高海娜等[22]和苗明軍等[23]成功利用SSR標記對甘藍雜交種秦甘50和西園4號進行純度鑒定；管志坤等[24]利用SSR標記鑒定油綠3號大白菜品種純度，鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果非常接近；SSR 標記廣泛用于西瓜[25]、黃瓜[26，27]、瓠瓜[28]、甜瓜[29，30]雜交種純度鑒定，初步建立了利用SSR分子標記鑒定瓜類作物雜交種純度的技術體系；大量研究表明，SSR標記可應用于玉米雜交種鄭單 958[31]、黔單 16[32]、寧單 11[33]純度鑒定，與田間鑒定相比，準確性更高，速度更快，能大大提高檢測效率；王利英等[34]和白占兵等[35]研究結(jié)果表明，利用SSR分子標記檢測茄科作物茄子和辣椒雜交種純度可行且高效，具有一定的理論和應用價值；陳志偉等[36]研究結(jié)果證明，利用SSR分子標記可以快速、有效地鑒定大麥雜交種純度；田蕾等[37]利用多對SSR標記鑒定大豆雜交種純度，檢測結(jié)果完全一致；趙振卿等[38]利用SSR標記對花椰菜雜交種浙801純度進行鑒定，鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果一致（表1）。

開發(fā)基因組SSR標記成本較高、步驟繁瑣、費時費力。EST-SSR （expressed sequence tag-simple sequence repeat）標記是根據(jù)EST序列中的簡單串聯(lián)重復序列開發(fā)的一種標記類型，具有SSR標記和EST技術的優(yōu)點，并且降低了開發(fā)成本、節(jié)省了開發(fā)時間、提高了開發(fā)效率，另外，EST序列高度的保守性使得EST-SSR標記在種與品種間有較好的通

用性，顯著提高了其利用價值。近年來，隨著基因組測序的發(fā)展，豐富的EST序列資源為EST-SSR標記的開發(fā)提供了有利途徑。盧銳等[39]篩選出2對EST-SSR標記，可用于黃瓜雜交種純度的鑒定；張庶等[40]研究結(jié)果表明，EST-SSR標記可以快速、準確地鑒別大白菜雜交種純度；張國裕等[41]利用ESTSSR標記對南瓜屬作物雜交種進行純度檢測，與田間鑒定結(jié)果相符；匡猛等[42]試驗結(jié)果證明，利用EST-SSR標記鑒定棉花雜交種純度與田間鑒定結(jié)果的相關性顯著高于基因組SSR標記；趙新等[43]篩選得到1對共顯性的EST-SSR標記，可用于花椰菜雜交種純度的鑒定，鑒定結(jié)果與田間形態(tài)鑒定結(jié)果較為一致。

表1 分子標記技術在作物雜交種純度鑒定中的應用

5 SRAP分子標記在鑒定作物雜交種純度中的應用

SRAP （Sequence-related amplified polymorphism）標記，即相關序列擴增多態(tài)性，該技術通過獨特的引物設計對基因的開放閱讀框區(qū)域進行擴增，上游引物與外顯子區(qū)域特異結(jié)合，下游引物與啟動子或內(nèi)含子區(qū)域結(jié)合，檢測不同個體間內(nèi)含子、啟動子及間隔區(qū)序列長度不同產(chǎn)生的多態(tài)性。

該標記技術具有操作簡單、高共顯性、穩(wěn)定性強、分辨率較高、重復性好、成本低、在基因組中分布均勻等特點，在作物雜交種純度鑒定中有著廣泛的應用。扈新民等[44]利用SRAP分子標記對辣椒雜交種航椒4號進行純度檢測，與田間鑒定結(jié)果十分接近。鐘開勤等[45]研究結(jié)果證明，SRAP標記可以用于花椰菜雜交種純度鑒定；張永平等[46]和熊麗曼等[47]成功利用SRAP標記對甜瓜雜交種進行純度檢測；黃建都等[48]研究結(jié)果表明，SRAP標記技術可用于甘藍雜交種夏華2號純度鑒定，鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果一致；蓋樹鵬等[49]試驗結(jié)果證明，與SSR標記相比，利用SRAP標記檢測雜交種純度更接近田間鑒定結(jié)果（表1）。

6 SNP和InDel分子標記在鑒定作物雜交種純度中的應用

隨著作物基因組測序工作的進展，新型分子標記 InDel （Insertion-deletion） 和 SNP （Single nucleotide polymorphism）的開發(fā)越來越容易，為利用新型分子標記進行作物雜交種純度鑒定創(chuàng)造了有利條件。InDel標記，即插入缺失標記，指由核苷酸水平上堿基的插入或缺失引起的多態(tài)性。SNP標記，即單核苷酸多態(tài)性，指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。

InDel和SNP標記具有數(shù)量豐富、穩(wěn)定性好、高通量和高度自動化等優(yōu)點。蘭青闊等[50]利用InDel標記檢測黃瓜津優(yōu)38雜交種純度，與SSR標記鑒定結(jié)果基本一致；張體付等[1]成功利用InDel標記對6個玉米雜交種進行了純度鑒定；蘭青闊等[51]基于SNP標記檢測黃瓜雜交種優(yōu)一種子純度，鑒定結(jié)果與SSR標記鑒定結(jié)果相符。

7 展望

隨著生物技術的不斷發(fā)展，作物雜交種純度鑒定技術也由主要依賴田間鑒定進入分子鑒定水平，分子標記技術因其快速、準確、穩(wěn)定、節(jié)省大量人力和財力以及不受環(huán)境因素影響等特點，逐步成為作物雜交種純度檢測的首選工具，為雜交種純度鑒定提供了一種更為有效和可靠的方法[52]。不同的分子標記技術具有不同的優(yōu)缺點，在實際應用中，要根據(jù)研究對象充分發(fā)揮標記技術優(yōu)勢，這樣才能更準確、快速地達到鑒定目的。

在作物雜交種制種過程中，由于隔離不嚴導致的生物混雜是不可避免的現(xiàn)象，因此，利用單對標記鑒定雜交種純度具有一定的局限性。為確保鑒定結(jié)果的準確性和可靠性，應同時對供試樣品的多個遺傳位點進行檢測分析。選取位于染色體不同區(qū)域的標記組合起來進行檢測，不僅可以區(qū)分親本自交種，還能有效檢測出其他來源花粉所導致的生物性混雜。

分子生物學技術的飛速發(fā)展將會導致新的分子標記不斷出現(xiàn)，現(xiàn)有的技術也會不斷得到完善。將分子標記技術與傳統(tǒng)育種方法相結(jié)合，可快速、準確地對雜交種純度進行早期檢測，對于保證種子質(zhì)量和優(yōu)良品種推廣具有重要意義。

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