回醫(yī)烙灸法對大鼠實(shí)驗(yàn)性腰椎間盤退變MMP-3表達(dá)的影響

許建峰，林瑞珠，牛子瞻，張躍全，武永利，王英絮

（寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，寧夏 銀川 750004）

椎間盤退變（intervertebral disc degeneration，IDD）是椎間盤突出、椎管狹窄、慢性下腰痛等疾病的主要原因之一，其發(fā)生、發(fā)展有多種炎性細(xì)胞和基質(zhì)金屬蛋白酶的參與。尋找有效的治療方法和途徑干預(yù)炎性細(xì)胞和金屬蛋白酶，延緩或抑制椎間盤退變的發(fā)生、發(fā)展是研究的難點(diǎn)［1］。目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)尚無有效方法防治椎間盤退變，基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）在退變過程中起著重要的作用已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)?；蒯t(yī)烙灸療法具有補(bǔ)腎強(qiáng)督、強(qiáng)筋健骨的作用，在治療椎間盤退變方面已取得良好的療效［2］。本實(shí)驗(yàn)采用回醫(yī)烙灸療法治療大鼠椎間盤退變，觀察大鼠的椎間盤組織Miyamoto分級變化，并通過免疫組織化學(xué)方法檢測MMP-3變化，為回醫(yī)烙灸療法治療腰椎間盤退變提供理論和實(shí)驗(yàn)根據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 健康2個(gè)月齡清潔級SD大鼠 45 只，雄性，體重（450±20）g，寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院動物中心提供，動物合格證號：SCKX（寧）2011－0013。將大鼠隨機(jī)分為模型組、假手術(shù)組和回醫(yī)烙灸組3組，每組各15只。

1.2 藥品及試劑 一抗為MMP-3多克隆抗體，二抗羊多克隆抗體（Santa Cruz公司），一抗按1∶75稀釋；免疫組化SABC試劑盒、PBS緩沖液、枸椽酸鹽緩沖液購于北京博奧生物工程有限公司；DAB顯色劑購于Gibco公司；6.5%的水合氯醛購于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院制劑中心；灸法所用艾絨購于寧夏醫(yī)藥公司［豫鄭食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2012第1270003號］；熒光顯微鏡（型號Nikon，日本Nikon公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動物造模 大鼠稱重，術(shù)前X線片定位，以6.5%的水合氯醛0.055 mL／kg腹腔注射麻醉。麻醉成功后腹部剪毛，清潔，仰臥位，固定四肢，碘伏消毒鋪巾。取右側(cè)旁正中切口，長約1.5～2.0 cm，遠(yuǎn)端略過髂嵴2～3 mm。將腸管及大網(wǎng)膜用濕紗布向頭側(cè)、對側(cè)推移，暴露腹后壁，剪開腹后膜，保護(hù)好下腔靜脈，將腰大肌從脊柱附著點(diǎn)上節(jié)段性剝離（髂嵴平對L6椎體或5～6椎間盤），暴露5～6椎間盤，利用21G微量穿刺針對以上椎間盤行穿刺，針刺角度與椎間盤矢狀面呈0°～60°，平行于軟骨終板進(jìn)針，穿刺深度為2.3 mm，針刺貫穿整個(gè)纖維環(huán)全層。針刺成功后，縫合腹膜層、肌層，關(guān)閉皮膚。假手術(shù)組SD大鼠僅切開皮膚后即縫合。

1.3.2 治療方法 ①回醫(yī)烙灸組：造模1個(gè)月后開始，將大鼠固定在用300 mL塑料飲料瓶自制的固定器上，特制的鐵器灸具放置在大鼠命門到腰俞的督脈及雙腎俞穴處，然后放上艾絨10 g在灸槽點(diǎn)燃，發(fā)熱鐵器灸具可使局部皮膚發(fā)紅發(fā)泡，5 d 1次，每次20 min，治療2個(gè)月后取材。② 模型組、假手術(shù)組：造模1個(gè)月后開始，不予任何干預(yù)手段，每5 d在固定器上固定20 min，治療2個(gè)月后取材。

1.3.3 取材 在大鼠治療2個(gè)月后將各組大鼠腹腔麻醉處死，取出完整的L5～6椎間盤組織，將標(biāo)本置入10%甲醛液固定48 h，持續(xù)流水沖洗1 h，梯度乙醇依次脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，待用。

1.4 形態(tài)學(xué)觀察 3組大鼠椎間盤組織石蠟包埋塊切片，組織切片平均厚度約4 μm，二甲苯脫蠟，梯度乙醇入水，流水沖洗片刻，蘇木精液及伊紅液染色，進(jìn)行光鏡觀察。按Miyamoto分級標(biāo)準(zhǔn)將椎間盤分為1～5 級，分別計(jì)為 1、2、3、4、5 分。

1.5 免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片脫蠟至水，加入3%H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS沖洗 3次，浸入0.01 mol／L枸椽酸鹽緩沖液并置于高壓鍋內(nèi)，15 min行抗原修復(fù)，室溫冷卻后PBS漂洗3次；5%BSA室溫封閉20 min，阻斷內(nèi)源性生物素，滴加一抗（1∶50 稀釋 MMP-3），4℃過夜。PBS漂洗 3次，滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫、濕盒內(nèi)孵育30 min，再次PBS漂洗3次；滴加DAB顯色劑，顯色適度后終止反應(yīng)；蘇木素復(fù)染、脫水、透明，封片。

1.6 圖像分析及處理 以熒光纖維鏡觀察陽性部位，細(xì)胞中成棕黃或棕褐色為MMP-3染色。每個(gè)組織標(biāo)本隨機(jī)選取不重疊的10個(gè)觀察視野，用LeicaQ500MC圖像系統(tǒng)進(jìn)行MMP-3表達(dá)的陽性細(xì)胞進(jìn)行定量測試。根據(jù)不同染色部位的灰度值，自動計(jì)算出陽性細(xì)胞的平均灰度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所得數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。計(jì)量資料呈正態(tài)分布的用表示，組間治療后呈正態(tài)分布的計(jì)量資料采用兩樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組形態(tài)分級評分觀察 見表1。

表1 3組對大鼠實(shí)驗(yàn)性退變腰椎間盤Miyamoto 分級標(biāo)準(zhǔn)（） 分

表1 3組對大鼠實(shí)驗(yàn)性退變腰椎間盤Miyamoto 分級標(biāo)準(zhǔn)（） 分

注：與模型組比較，1） P＜0.01；與假手術(shù)組比較，2） P＜0.05。

組 別回醫(yī)烙灸組假手術(shù)組模型組形態(tài)學(xué)分級評分2.31±0.481）2）1.91±0.531）3.02±0.71 n 15 15 15

2.2 3組免疫組織化學(xué)檢測 見表2。

表2 3組對大鼠實(shí)驗(yàn)性退變腰椎間盤中 MMP-3 表達(dá)的影響（）

表2 3組對大鼠實(shí)驗(yàn)性退變腰椎間盤中 MMP-3 表達(dá)的影響（）

注：與模型組比較，1） P＜0.05。

平均光密度值（MOD）0.19±0.011）0.16±0.021）0.36±0.03組 別回醫(yī)烙灸組假手術(shù)組模型組n 15 15 15

3 討 論

隨著社會人口老齡化進(jìn)程的加快，IDD將成為前所未有的公共衛(wèi)生問題，輕者引起慢性頸臂痛或腰腿痛，重者引起神經(jīng)功能障礙甚至截癱［3］。所以，目前對椎間盤退變內(nèi)源性機(jī)制和防治措施等方面進(jìn)行縱深研究具有迫切性和重要性［4］。

椎間盤退變引發(fā)多種復(fù)雜的生物學(xué)效應(yīng)：①促進(jìn)椎間盤細(xì)胞凋亡；② 影響椎間盤基質(zhì)合成；③ 促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白合成及基質(zhì)破壞；④通過誘導(dǎo)IL-1、IL-6等致炎因子的產(chǎn)生而使椎間盤的內(nèi)環(huán)境產(chǎn)生惡性循環(huán)［5］。然而在這些的變化中，椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)的變化是椎間盤退變及生物力學(xué)改變的至關(guān)重要的因素。研究表明：MMPs是分解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶中最重要的一類，其中MMP-3在細(xì)胞外基質(zhì)的降解中起關(guān)鍵的作用［6］。MMP-3不僅能降解蛋白多糖和糖蛋白，還能分解多種類型的膠原纖維，從而加劇椎間盤的退變和椎間盤組織水分的丟失。椎間盤的退變是遺傳、機(jī)械、物理、生物學(xué)和炎癥刺激等諸多因素綜合作用的結(jié)果，這些因素組成了一個(gè)極其龐大復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，而MMP-3是這個(gè)網(wǎng)絡(luò)中的比較重要一環(huán)，在椎間盤退變過程中起到舉足輕重的作用，同時(shí)MMP-3也受到諸多因素的調(diào)控和影響。因此，抑制MMP-3的活性，從而調(diào)控其對細(xì)胞外基質(zhì)蛋白多糖和膠原纖維的降解作用以減緩椎間盤退變，這是研究減緩和治療椎間盤退變的一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)和重要作用靶點(diǎn)［7］。

腰椎間盤退變屬中醫(yī)和回醫(yī)的 “痹病”、“腰痛”范疇。病機(jī)為肝腎不足，筋骨失養(yǎng)?；蒯t(yī)認(rèn)為本病主要由肝腎不足導(dǎo)致的腰部四液、四性失衡所致。回醫(yī)烙灸療法是用烙藥或鐵器燒灼直接烙燙于病痛或患處的體表部位，使得局部皮膚發(fā)紅發(fā)泡，促使機(jī)體康復(fù)的一種治療方法，治療需達(dá)到“灸時(shí)須使皮破”的效果。這種獨(dú)具特色的灸法，是祖國醫(yī)學(xué)“化膿灸”的發(fā)展與深化。回醫(yī)烙灸療法排出患處異常體液及代謝衰敗過程中的四液病理產(chǎn)物，從而促進(jìn)四性、四液平衡，最終達(dá)到人體所需要的體液平衡和陰陽平衡?；蒯t(yī)烙灸療法風(fēng)格獨(dú)特，對疾病的治療可達(dá)到“病根盡去”的目的［2］?；蒯t(yī)烙灸療法較中醫(yī)化膿灸刺激面大，治療溫度可以根據(jù)鐵制灸具灸槽中艾絨的多少來調(diào)節(jié)，鐵制灸具有傳熱快、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，臨床上深受患者的喜愛。

烙灸療法有補(bǔ)腎強(qiáng)督、強(qiáng)筋健骨作用，同時(shí)通過起泡化膿可以排出腰椎局部寒、濕、瘀血等病理產(chǎn)物，從而達(dá)到扶正驅(qū)邪的目的。通過本實(shí)驗(yàn)研究表明：回醫(yī)烙灸法可明顯減少大鼠退變腰椎間盤組織中MMP-3的陽性表達(dá)的強(qiáng)度。我們通過前期研究發(fā)現(xiàn)化膿灸可以顯著降低椎間盤退變的IL-6，有部分學(xué)者認(rèn)為它與椎間盤退變程度呈正相關(guān)，下調(diào)基質(zhì)蛋白的表達(dá)，上調(diào) MMPs和 ADAMTs的轉(zhuǎn)錄［8］?；蒯t(yī)烙灸法通過對炎癥因子的介導(dǎo)，達(dá)到降低MMP-3的表達(dá)，進(jìn)一步減少了軟骨細(xì)胞的凋亡，減少細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白多糖及II型膠原纖維等的降解，促使椎間盤退變延緩，形態(tài)學(xué)評分下降。因此有必要對回醫(yī)烙灸治療椎間盤退變進(jìn)行更加深入的機(jī)制探討，為其治療椎間盤退變提供理論和實(shí)驗(yàn)根據(jù)。

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