Pep-1-vMIP-Ⅱ?qū)π∈罂笻IV-Ⅰ基因表達(dá)的作用

高 媛，南玉龍，楊 磊*，譚曉華，尹洪萍，汪 浩

病毒巨噬細(xì)胞炎性蛋白Ⅱ(viral macrophage inflammatory protein-Ⅱ，vMIP-Ⅱ)是由人皰疹病毒8(human herpes virus 8，HHV-8)K4基因編碼的病毒蛋白，是一種廣譜的趨化因子拮抗劑，對CC和CXC類趨化因子受體有高度的親和性［1］。并抑制I型人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus typeⅠ，HIV-Ⅰ)通過共受體CCR3和CCR5以及CXCR4介導(dǎo)進(jìn)入CD4+靶細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，干擾HIV-Ⅰ的gp120與輔助受體的結(jié)合從而抑制 HIV-Ⅰ的感染［2］。Pep-1是一種人工合成的細(xì)胞穿膜肽(cell penetrating peptides，CPPs)，共 21個氨基酸殘基:KETWWETWWTEWSQPKKKRKV［3］?？梢愿咝мD(zhuǎn)移各種天然構(gòu)象、完全生物活性的多肽和蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)而發(fā)揮生物效應(yīng)［4-5］。本研究通過原核表達(dá)Pep-1-vMIP-Ⅱ融合蛋白，皮膚涂抹ICR小鼠檢測其在不同組織的分布情況以確定其穿透皮膚和生理屏障的功能;檢測MX1、MX2、APOBEC3轉(zhuǎn)錄本1和2、CCL5等艾滋病抗性基因(AIDS resistance genes，ARGs)［6］mRNA 表達(dá)水平，以探討融合蛋白 Pep-1-vMIP-Ⅱ在影響宿主ARGs表達(dá)抵抗HIV-Ⅰ感染中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物:SPF級ICR小鼠，體質(zhì)量(20±2)g，30只，雌雄各半，杭州師范大學(xué)實驗動物中心提供(合格證號:scxk-0048)。晝夜(12/12 h)節(jié)律光照條件下，自由進(jìn)食飲水，室溫18～22℃，單獨(dú)飼養(yǎng)1 d適應(yīng)環(huán)境后進(jìn)行實驗。實驗遵守國家《實驗動物管理條例》法律規(guī)定保證動物質(zhì)量。

1.1.2 Pep-1-vMIP-Ⅱ蛋白:菌株 Escherichia coli BL21(DE3)plysS、DH5α、表達(dá)質(zhì)粒 pET11a-Pep-1-vMIP-Ⅱ和pET11a-vMIP-Ⅱ為本實驗室保存。

1.1.3 主要試劑:蛋白純化試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒(Pierce公司);超濾管(Millipore公司);預(yù)染蛋白質(zhì)marker(Fermentas公司);RNA提取試劑盒、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green熒光實時定量試劑盒(TakaRa大連寶生物公司);生物素化的山羊抗小鼠IgG二抗(武漢博士德生物工程有限公司);定量引物由上海桑尼生物科技有限公司合成;其余常規(guī)試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌轉(zhuǎn)化、培養(yǎng):用pET11a-Pep-1-vMIP-Ⅱ、pET11a-vMIP-Ⅱ重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Escherichia coli BL21(DE3)plysS，形成穩(wěn)定的高表達(dá)細(xì)菌株。在含50μg/mL氨芐青霉素和34μg/mL氯霉素的LB平板上劃線培養(yǎng)，37℃過夜。挑取單克隆菌落測序正確后，接種至5 mL含50μg/mL氨芐青霉素和34μg/mL氯霉素的 LB培養(yǎng)液，37℃，250 r/min培養(yǎng)至對數(shù)生長期，無菌條件下取樣檢測A600。

1.2.2 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)純化:取3 mL上述培養(yǎng)液加入200 mL LB培養(yǎng)基中，37℃ 250 r/min培養(yǎng)至A600約為0.5～1.0。誘導(dǎo)前取1 mL菌液作為未誘導(dǎo)對照。剩余LB加入IPTG至終濃度為0.2 mmol/L、28℃下誘導(dǎo)7 h獲得表達(dá)量相對較高的可溶性蛋白，經(jīng)Ni-NTA親和層析，超濾除鹽純化獲得高純度的融合蛋白Pep-1-vMIP-Ⅱ和vMIP-Ⅱ，15% 分離膠進(jìn)行SDSPAGE 分析［7］。

1.3 實驗方案和分組

純化獲得的融合蛋白分別用PBS(磷酸鹽緩沖液，pH值7.35)溶解配制成0.1 g/L終濃度。剔除每只小鼠背部毛發(fā)，碘伏、75%乙醇消毒，無菌0.9%氯化鈉注射液沖洗，自然晾干后按20μg/只ICR小鼠，涂抹范圍2 cm×2 cm，單籠飼養(yǎng)。實驗分組(表 1)。

涂抹后2 h心臟穿刺取血后處死小鼠，每組5只。取腎臟等主要組織，4%中性甲醛固定24 h，包埋成0.4 cm×0.3 cm×0.3 cm蠟塊，并制備成4μm連續(xù)切片，免疫組織化學(xué)分析檢測vMIP-Ⅱ的穿膜與組織分布情況。涂抹24 h后心臟穿刺取血后處死小鼠，每組5只。血液EDTA抗凝。迅速取材，液氮速凍后轉(zhuǎn)移-80℃保存，提取組織RNA。

表1 實驗分組Table 1 The groups of experiment

1.4 實時定量PCR

測定涂抹Pep-1-vMIP-Ⅱ24 h后ARGs mRNA相對表達(dá)水平。

1.4.1 總RNA提取:新鮮血液RNA的提取(100μL全血加2 mL LRNAiso Plus);其余組織-80℃取出后，液氮速凍并研磨成粉末狀，按照TakaRa公司技術(shù)指南完成組織RAN提取。

1.4.2 反轉(zhuǎn)錄 PCR:總 RNA反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，按TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明配制。

1.4.3 實時定量PCR:SYBR GreenⅠ熒光染料嵌合法在ABI7300定量PCR儀上檢測。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)設(shè)計合成小鼠ARGs基因的qRT-PCR擴(kuò)增引物(表2)。PCR反應(yīng)體系為:SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ(2×)10μL，PCR 正向引物(10μmol/L)0.8μL，PCR反向引物(10μmol/L)0.8μL，ROX Reference Dye(50×)0.4μL，RT產(chǎn)物(cDNA 溶液)2μL，加ddH2O至20μL。反應(yīng)程序:95℃ 30 s 1個循環(huán);95℃ 5 s，60℃ 31 s 40個循環(huán);95℃ 15 s，60℃60 s，95℃ 15 s1個循環(huán)。每個樣本做3個復(fù)孔，求平均 Ct值，采用 2-ΔΔct法計算相對表達(dá)量［8］。

1.5 免疫組織化學(xué)分析

vMIP-Ⅱ用0.05%胰蛋白酶修復(fù)，37℃ 20 min;vMIP-Ⅱ(1∶25)4℃過夜;余步驟按試劑盒操作。顯微鏡(Olympus IX51)觀察、圖像采集系統(tǒng)將3組切片按照同一采集參數(shù)拍攝，每張切片隨機(jī)采集×400圖像5張。Image-Pro Plus 6.0分析數(shù)據(jù)。HIS(H-60;I-255;S-255)選擇陽性顯色的方法，積分吸光度值(integrated absorbance values，IA)為統(tǒng)計指標(biāo)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

GraphPad prism 5.0軟件分析并繪制圖表，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，組化結(jié)果采用單因素方差分析和Kruskal-Wallis檢驗。qRT-PCR結(jié)果采用雙因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 純化并鑒定Pep-1-vMIP-Ⅱ融合蛋白

相對分子質(zhì)量12 000 u附近出現(xiàn)特異性條帶，與重組表達(dá)的融合蛋白Pep-1-vMIP-Ⅱ大小一致(圖1)。

2.2 Pep-1-vMIP-Ⅱ在ICR小鼠體內(nèi)的穿膜情況

圖1 融合蛋白Pep-1-vMIP-Ⅱ的誘導(dǎo)表達(dá)Fig 1 The induced expression of fusion protein Pep-1-vMIP-Ⅱ

表2 定量引物序列Table 2 Primer sequences used for qRT-PCR

圖2 腎臟組織中vMIP-Ⅱ分布情況Fig 2 The distribution of vMIP-Ⅱ in kidney(×400)

Pep-1-vMIP-Ⅱ可以在2 h后穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，圖2黑色箭頭所指為陽性表達(dá)部位。3組中Pep-1-vMIP-Ⅱ的IA在腎臟內(nèi)的分布明顯增加(p＜0.05)，Pep-1-vMIP-Ⅱ 組顯著高于 BSA和vMIP-Ⅱ組(P ＜0.05)(表3)。

表3 不同實驗組間IA的比較Table 3 Comparisons of IA between BSA，vMIP-Ⅱand Pep-1-vMIP-Ⅱ，n=5)

表3 不同實驗組間IA的比較Table 3 Comparisons of IA between BSA，vMIP-Ⅱand Pep-1-vMIP-Ⅱ，n=5)

＊P ＜0.05 compared with BSA and vMIP-Ⅱ.

group IA(x±s)BSA 8 810±479 vMIP-Ⅱ 9 611 ±421 Pep-1-vMIP-Ⅱ 14 103 ±526*

2.3 Pep-1-vMIP-Ⅱ?qū)?ICR小鼠ARGs基因 mRNA表達(dá)水平的影響

24 h后，實驗組pep1-vMIP-Ⅱ與對照組vMIP-Ⅱ間相比，MX1、MX2在多種組織中表達(dá)都顯著增加(p＜0.05)，但MX2在心、肝、腦中的表達(dá)變化不顯著;CCL5在白細(xì)胞、肺、腎、心及肝中表達(dá)都顯著增加(p＜0.05)，腦組織中CCL5的表達(dá)未見明顯差異;APOBEC3轉(zhuǎn)錄本1在白細(xì)胞中表達(dá)顯著增加(p＜0.05)，APOBEC3轉(zhuǎn)錄本1和2在其余組織表達(dá)未見明顯差異(圖3)。

圖3 不同組織中ARGs mRNA表達(dá)水平Fig 3 Expression of ARGs mRNA levels in different organs，n=5)

3 討論

本研究結(jié)果顯示融合蛋白Pep-1-vMIP-Ⅱ可以穿透皮膚、黏膜并進(jìn)入細(xì)胞系內(nèi)，主要分布于腎臟組織。vMIP-Ⅱ選擇性吸引Ⅱ型T細(xì)胞改變白細(xì)胞的趨化性，是宿主適應(yīng)性黏膜免疫系統(tǒng)防御病毒入侵的重要機(jī)制，也是病毒逃避宿主免疫反應(yīng)的主要策略［9］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，vMIP-Ⅱ可以上調(diào)宿主一些ARGs的表達(dá)［7］，這可能是vMIP-Ⅱ發(fā)揮抗 HIV 功能的另一重要分子機(jī)制。同時本研究結(jié)果表明Pep-1-vMIP-Ⅱ可以上調(diào)宿主ARGs基因mRNA表達(dá)水平，主要是通過上調(diào)CCL5在白細(xì)胞、肺、腎、心、肝中表達(dá)發(fā)揮其生物學(xué)功能。vMIP-Ⅱ結(jié)合共受體CCR5、CXCR4是 vMIP-Ⅱ抗 HIV-Ⅰ感染關(guān)鍵步驟［10］，因此闡明激活體內(nèi)ARGs基因的表達(dá)機(jī)制對vMIP-Ⅱ應(yīng)用于臨床防治艾滋病具有重要意義。

有研究發(fā)現(xiàn)，vMIP-Ⅱ基因轉(zhuǎn)染HUVEC細(xì)胞可以促進(jìn) APOBEC3G，RANTES以及 OAS-1，-2，-3等多條ARGs的表達(dá)增加［11］。提示KSHV感染可能通過上調(diào)機(jī)體一系列抗HIV-Ⅰ基因表達(dá)發(fā)揮抗AIDS的作用，為此本項目研究了Pep-1-vMIP-Ⅱ?qū)CR小鼠ARGs基因表達(dá)的影響。發(fā)現(xiàn)廣譜抗病毒基因MX1、MX2在多種組織都上調(diào)。另有報道獼猴感染猴免疫缺陷病毒后APOBEC3 mRNA水平與血漿病毒載量呈負(fù)相關(guān)，在長期不進(jìn)展(LTNPs)階段 APOBEC3 mRNA水平升高［12］。同時發(fā)現(xiàn)在外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)主要是CD4+T細(xì)胞和艾滋病毒暴露血清陰性反應(yīng)的個體宮頸癌組織中APOBEC3G表達(dá)顯著增加［13］。而本研究中APOBEC3轉(zhuǎn)錄本1和2未見到明顯變化。CCL5 mRNA在白細(xì)胞、腎、心、肝、肺多種組織中表達(dá)上調(diào)。CCL5與 CCR1、CCR3、CCR5結(jié)合后，可激活7次跨膜G蛋白耦聯(lián)受體(GPCRs)途徑和磷酸化酪氨酸激酶(PTKs)途徑，刺激胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，轉(zhuǎn)錄因子、核因子活化，特定基因表達(dá)或不表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞因子分泌［10，14］。CCL5 通過空間位阻效應(yīng)阻斷 HIV-Ⅰgp120 與 CCR5 結(jié)合［15］，而Pep-1-vMIP-Ⅱ融合蛋白能夠與CCL5競爭性結(jié)合，并上調(diào)宿主CCL5基因表達(dá)水平，主要通過下調(diào)CCR5表達(dá)阻斷受體內(nèi)吞后的再循環(huán)而發(fā)揮抗HIV-Ⅰ的作用。

綜上所述，Pep-1可以攜帶vMIP-Ⅱ蛋白進(jìn)入生物體內(nèi)，同時vMIP-Ⅱ 作為廣譜的人趨化因子受體封閉劑，這兩個特性為將Pep-1-vMIP-Ⅱ開發(fā)成為一種方便、無痛的藥物提供可能，并為HIV-Ⅰ/AIDS的防治提供可能。

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