魷魚墨多糖改善小鼠腸粘膜免疫及作用機(jī)制的研究

左 濤，李學(xué)敏，曹 露，王靜鳳，王玉明，李兆杰，薛長(zhǎng)湖，唐慶娟

(中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院山東青島 266003)

腸道不僅是消化吸收的重要場(chǎng)所，也是生物體最大的免疫器官。腸道粘膜面積龐大，它的結(jié)構(gòu)和功能構(gòu)成了強(qiáng)大的粘膜免疫系統(tǒng)。腸粘膜免疫是全身免疫的一部分，其功能不僅僅作用于腸粘膜，還參與全身免疫功能的調(diào)節(jié)。分泌型IgA(SIgA)是由小腸上皮細(xì)胞分泌的免疫球蛋白，在腸道粘膜表面起到重要的免疫保護(hù)作用，用以抵抗外來(lái)微生物如細(xì)菌、病毒、寄生蟲等的入侵，是腸道免疫屏障的主要效應(yīng)因子。腸道SIgA主要是通過(guò)小腸上皮細(xì)胞的pIgR(多聚免疫球蛋白受體)穿胞轉(zhuǎn)運(yùn)dIgA從而分泌到細(xì)胞外的，在腸腔中 SIgA發(fā)揮粘膜防御功能［1－3］。當(dāng)腸道的免疫屏障受到應(yīng)激、化療藥物(如環(huán)磷酰胺)、免疫抑制劑、燒傷等內(nèi)部或外界因素影響而被削弱時(shí)，輕者發(fā)生腸炎，重者甚至?xí)＜吧?］。因此，保護(hù)腸道粘膜免疫屏障的完整性，維持SIgA的正常分泌，對(duì)于防治腸源性感染、保護(hù)人類健康至關(guān)重要。

大量研究表明，許多多糖類物質(zhì)可以明顯改善機(jī)體免疫力。但是，具有改善腸道免疫促進(jìn)SIgA分泌活性的多糖類物質(zhì)鮮有報(bào)道。魷魚墨主要由黑色素和富含巖藻糖的粘多糖組成，具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、升高白細(xì)胞、抗輻射以及促凝血等多種生理活性，是一種極具應(yīng)用潛力的天然資源［5］。已有報(bào)道證實(shí)，魷魚墨黑色素具有免疫調(diào)節(jié)作用［6］，而且魷魚墨粘多糖也能夠明顯改善氫化可的松所致的小鼠免疫功能低下?tīng)顩r［7］。但迄今尚未見(jiàn)魷魚墨多糖與腸道粘膜免疫關(guān)系的報(bào)道。

北太平洋魷魚(Ommastrephes bartrami)是目前的一種主要捕撈和加工魷魚品種，在中國(guó)、日本都有較高的產(chǎn)量。其個(gè)體墨囊相對(duì)較大，一般一個(gè)成熟魷魚的魷魚墨囊大約占其體重的1.3%，而在其加工過(guò)程中，墨囊往往作為廢棄物丟棄，一些國(guó)家甚至為處理這些加工廢棄物投入大量的財(cái)力和物力。因此，研究魷魚墨的加工再利用具有重要的意義。本文主要研究魷魚墨多糖對(duì)免疫低下模型小鼠的腸道免疫調(diào)節(jié)作用，旨在篩選出改善腸粘膜免疫的活性成分，為魷魚墨多糖在食品、營(yíng)養(yǎng)保健等領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 魷魚墨囊 北太平洋魷魚墨囊，由浙江舟山漁業(yè)公司提供，－20℃凍藏，使用時(shí)于0℃解凍。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康♂Balb/c小鼠50只(體質(zhì)量18－22 g)，SPF級(jí)，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào):SCXK(京)2007－0001;

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 試劑:氯化鈉，甲醛(10%)，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，均為國(guó)產(chǎn)分析純;環(huán)磷酰胺購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司;膜蛋白提取試劑盒(上海生工);Mouse SIgA ELISA Kit(武漢USCNK);Mouse pIgR ELISA Kit(武漢 USCNK);Mouse IgA antibody(Bethyl Laboratories);山羊抗SABC免疫組化試劑盒(博邁德);濃縮型DAB試劑盒(Solarbio);TRIzol(Invitrogen);M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega);dNTP(TaKaRa);RNase inhibitor(Roche);隨機(jī)引物B0043-9(上海生工生物工程有限公司);儀器:高速臺(tái)式離心機(jī)TGL-16G(上海安亭科學(xué)儀器廠);酶標(biāo)儀Model680(美國(guó)Bio RAD產(chǎn)品);全溫振蕩培養(yǎng)箱(HZQ-F)(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司);電熱恒溫水浴鍋(HHS-Ni)(北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠)，光學(xué)顯微鏡(Olympus BX41)，凝膠成像系統(tǒng)(Tanon GIS-2000，上海天能科技有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 魷魚墨粗多糖制備 魷魚墨囊解凍去皮經(jīng)水浸泡過(guò)夜，超速離心后得到魷魚墨上清液。上清液經(jīng)木瓜蛋白酶酶解、醇沉、丙酮洗，再經(jīng)三氯乙酸除去雜蛋白，所得溶液透析后經(jīng)真空冷凍干燥，得魷魚墨粗多糖樣品。粗多糖的得率約為1.5%(m/V)，粗多糖樣品中多糖含量使用苯酚－硫酸法檢測(cè)濃度為68.9%，蛋白含量使用福林－酚法檢測(cè)濃度為8.9%。

1.4.2 環(huán)磷酰胺腹腔注射液劑量的確定 通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)將36只Balb/c小鼠，按體重隨機(jī)分成6組，每組6只，分別為1組正常組小鼠和5組環(huán)磷酰胺模型組小鼠。5組環(huán)磷酰胺模型組小鼠分別連續(xù)腹腔注射環(huán)磷酰胺(50 mg·kg－1)1、2、3、4、5 d，d6 脫頸椎處死小鼠。刮取腸粘膜，測(cè)定脾指數(shù)、胸腺指數(shù)和腸粘膜SIgA分泌量。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)連續(xù)2 d注射環(huán)磷酰胺已造成胸腺、脾嚴(yán)重受損，SIgA分泌量也明顯下降。故確定環(huán)磷酰胺最終注射劑量與時(shí)間為:連續(xù)2 d腹腔注射環(huán)磷酰胺(50 mg·kg－1)構(gòu)建機(jī)體免疫下降小鼠模型。

1.4.3 魷魚墨多糖灌胃劑量確定 通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)將50只Balb/c小鼠，按體重隨機(jī)分成5組，選擇魷魚墨多糖灌胃劑量為 2 mg·kg－1、20 mg·kg－1、200 mg·kg－1，28 d灌胃飼養(yǎng)。于第25天開(kāi)始連續(xù)兩天給予小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺(50 mg·kg－1)處理。第28天殺鼠刮取腸粘膜通過(guò)酶聯(lián)免疫反應(yīng)試劑盒測(cè)定腸道SIgA分泌量與脾指數(shù)、胸腺指數(shù)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)各組中僅200 mg·kg－1劑量魷魚墨多糖具有明顯改善胸腺指數(shù)、脾指數(shù)與腸粘膜SIgA的功效。故將后續(xù)試驗(yàn)小鼠灌胃劑量確定為50、100、200 mg·kg－1。

1.4.4 動(dòng)物分組 將50只Balb/c小鼠，按體重隨機(jī)分成5組:正常對(duì)照組、模型組、低、中、高劑量組，每組10只(飼養(yǎng)在專門動(dòng)物飼養(yǎng)籠內(nèi)，給予清潔無(wú)菌喂養(yǎng))。飼養(yǎng)小鼠28 d，每日給以小鼠低、中、高劑量組分別灌胃魷魚墨多糖50、100、200 mg·kg－1，正常組、模型組分別灌服同等體積的生理鹽水;并每日記錄體重;最后連續(xù)2 d，模型組、低、中、高劑量組腹腔注射環(huán)磷酰胺(50 mg·kg－1)，正常組注射等體積的無(wú)菌生理鹽水。第28天小鼠禁食不禁水12 h，脫頸椎處死小鼠檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.4.5 胸腺指數(shù)/脾指數(shù) Balb/c小鼠于末次給藥后，禁食不禁水12 h，分別稱重，脫頸椎處死，剝離胸腺、脾臟稱重并計(jì)算胸腺/體重和脾臟/體重比值。

1.4.6 小腸組織切片及HE染色結(jié)構(gòu)觀察 小鼠處死后，沿腹部正中線切開(kāi)，取出靠近空腸5～10 cm片段于中性甲醛中固定。將甲醛固定的小腸組織于進(jìn)行小腸石蠟包埋、組織切片制備與HE染色，中性樹膠封片。

1.4.7 小腸粘膜SIgA含量測(cè)定 沿小鼠腹部正中線切開(kāi)，用鑷子與剪刀小心取出靠近十二指腸段的空腸約5 cm稱重，刮取腸粘膜，溶于2 ml PBS(pH 7.4)，于 5 000 r·min－1，5 min 離心收集上清，按mouse SIgA ELISA Kit試劑盒(武漢USCNK)說(shuō)明書操作檢測(cè)單位質(zhì)量小腸內(nèi)SIgA含量。

1.4.8 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)小腸固有層IgA表達(dá)量 小腸石蠟切片組織經(jīng)常規(guī)脫蠟至水，0.3%甲醇過(guò)氧化氫輕搖孵育30 min以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，胰蛋白酶37℃ 10 min，IgA抗體4℃孵育過(guò)夜，二抗37℃孵育1 h，DAB顯色5 min，PBS終止顯色，蘇木素復(fù)染，蒸餾水1 min，脫水，中性樹膠封片，置于顯微鏡下觀察。

1.4.9 小腸pIgR含量測(cè)定 截取0.1 g小鼠空腸，經(jīng)膜蛋白提取試劑盒法提取總膜蛋白，按mouse pIgR ELISA Kit試劑盒(武漢USCNK)說(shuō)明書操作檢測(cè)小腸內(nèi)pIgR含量。

1.4.10 RT-PCR法檢測(cè)小腸pIgR mRNA表達(dá)量截取0.1 g小鼠空腸采用TRIzol法提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度，OD260/OD280為1.8～2.0，于－80℃冰箱保存。取1 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，并取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA用于PCR擴(kuò)增，以β-actin的表達(dá)量為內(nèi)參。β-actin上游引物:5'-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3'，下游引物:5'-ATGTCACGCACGATTTCCC-3';pIgR上游引物5'-CAGACATTAGCATGGCAGACTTCAA-3'，下 游 引物5'-TGCCGAGTAGGCCATGTCAG-3';PCR條件:94℃ 2 min;變性、退火、延伸各為 94℃ 30 s、53℃30 s、72℃ 1 min，重復(fù)23個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠(EB+)中電泳，紫外光(300 nm)觀察并照相記錄，用Image J軟件進(jìn)行灰度掃描比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體重變化 小鼠飼養(yǎng)結(jié)束時(shí)，模型組和魷魚墨多糖各劑量組小鼠的平均體重均低于正常組，差異有顯著性(P＜0.05)(Fig 1)。在未注射環(huán)磷酰胺之前，各組小鼠體重均處于緩慢上升趨勢(shì)，但從第25天腹腔注射環(huán)磷酰胺之后，模型組和魷魚墨多糖劑量組小鼠體重逐漸下降(Fig 1)，但各劑量組小鼠體重均高于環(huán)磷酰胺模型組小鼠。環(huán)磷酰胺作為一種烷化劑類化療藥物，對(duì)快速增殖的細(xì)胞具有損傷作用。腸道上皮細(xì)胞增殖迅速，容易受到環(huán)磷酰胺的損傷。本研究中注射環(huán)磷酰胺小鼠的體重均下降，提示環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠腸道具有損傷作用。魷魚墨多糖有改善小鼠體重的趨勢(shì)，提示魷魚墨多糖對(duì)腸道損傷具有一定的修復(fù)作用。

Fig 1 Change of mouse bodyweight

2.2 脾指數(shù)/胸腺指數(shù) 胸腺和脾臟是重要的免疫器官，胸腺的主要功能是產(chǎn)生T淋巴細(xì)胞和分泌胸腺素，主要參與細(xì)胞免疫;脾臟中有豐富的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞比例較大，因此與體液免疫關(guān)系更為密切。其重量與其功能以及其中免疫細(xì)胞數(shù)量有關(guān)。所以臟器指數(shù)可在一定程度上反映機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱。研究中環(huán)磷酰胺模型組小鼠的胸腺指數(shù)與脾指數(shù)均低于正常組小鼠并有差異顯著性(P＜0.01)，而且魷魚墨多糖可明顯提高環(huán)磷酰胺所致免疫低下小鼠的脾指數(shù)、胸腺指數(shù)(Fig 2)。雖然魷魚墨多糖劑量組小鼠脾指數(shù)與胸腺指數(shù)均未達(dá)到正常水平，但是與模型對(duì)照組相比，低、中、高劑量組的脾指數(shù)分別提高了12.7%、13.1%、15.6%，胸腺指數(shù)分別提高了53.5%、67.6%、61.8%，差異均有顯著性(P＜0.05)。由此提示，魷魚墨粗多糖可以改善免疫低下小鼠的免疫功能。

Fig 2 Effects of Squid Ink glycosaminoglycan on immune function in immunosuppressed mice

2.3 腸粘膜的結(jié)構(gòu)完整性 環(huán)磷酰胺可以導(dǎo)致機(jī)體免疫低下，而增殖更新較快的腸道作為機(jī)體最大的免疫器官易受化療藥物環(huán)磷酰胺的損傷。小腸組織切片HE染色觀察小腸粘膜結(jié)構(gòu)(Fig 3)，結(jié)果提示連續(xù)2 d注射環(huán)磷酰胺(50 mg·kg－1)后，小腸絨毛的完整性與形態(tài)結(jié)構(gòu)未有明顯變化。小腸絨毛的上皮細(xì)胞排列、固有層結(jié)構(gòu)、腸隱窩結(jié)構(gòu)等均未有明顯變化。且模型組小鼠和魷魚墨劑量組小鼠中均未出現(xiàn)上皮細(xì)胞明顯病理?yè)p傷、炎癥浸潤(rùn)、白細(xì)胞穿越進(jìn)入固有層等現(xiàn)象。說(shuō)明此劑量的環(huán)磷酰胺注射小鼠并未引起腸道明顯病理反應(yīng)。

2.4 腸粘膜SIgA含量 雖然連續(xù)2 d注射環(huán)磷酰胺(50 mg·kg－1)并未引起腸道明顯生理結(jié)構(gòu)變化，但腸粘膜免疫功能亦與腸道許多免疫因子，如獲得性免疫因子SIgA有重要關(guān)系。因此在研究中我們進(jìn)一步探討了環(huán)磷酰胺與魷魚墨多糖對(duì)腸粘膜SIgA的影響。通過(guò)單位質(zhì)量小腸內(nèi)腸粘膜SIgA的含量比較研究(Tab 1)可以看出，模型組小鼠腸道SIgA的含量明顯低于正常組(P＜0.01)，作為腸道免疫屏障重要效應(yīng)因子的SIgA分泌量明顯降低說(shuō)明腸道抵抗外來(lái)微生物的能力及腸道粘膜的免疫保護(hù)作用明顯下降，提示環(huán)磷酰胺可以造成腸粘膜SI-gA損傷。與模型組相比，魷魚墨多糖低、中、高劑量組小鼠SIgA的含量均明顯高于模型組(P＜0.05)，說(shuō)明魷魚墨多糖對(duì)腸粘膜損傷小鼠的SIgA分泌具有改善作用，并且這種改善作用具有劑量依賴性。

Tab 1 Comparison of SIgA content in mouse small intestine

2.5 小腸固有層IgA的表達(dá)量 SIgA的分泌主要依賴于分泌IgA的漿細(xì)胞，以及表達(dá)pIgR的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)功能。為了探討魷魚墨多糖促進(jìn)腸道SIgA分泌的作用機(jī)制，本研究對(duì)小鼠腸道IgA和pIgR的表達(dá)量進(jìn)行了研究。

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示(Fig 4):相比正常組，模型組小鼠小腸固有層的IgA染色明顯較淺，表明環(huán)磷酰胺會(huì)造成腸粘膜IgA的表達(dá)量減少。與模型組相比，魷魚墨粗多糖低劑量組表達(dá)量有明顯變化，且中、高劑量組的小腸固有層IgA明顯染色較深，高劑量組IgA染色尤為深。結(jié)果表明，北太平洋魷魚墨多糖可以改善小腸固有層IgA的表達(dá)受損情況，并且呈劑量依賴性。

2.6 腸pIgR mRNA與蛋白質(zhì)表達(dá)量 小腸上皮細(xì)胞為腸道粘膜免疫的重要物理屏障，在其基底膜側(cè)表達(dá)的pIgR負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)固有層IgA并形成SIgA，以發(fā)揮免疫清除腸道有害因子的作用。為了探究魷魚墨多糖改善腸粘膜SIgA的功效，是否與促進(jìn)pIgR的表達(dá)有關(guān)，本研究對(duì)pIgR的mRNA與蛋白質(zhì)表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)。小腸pIgR的RT-PCR結(jié)果(Fig 5)提示:環(huán)磷酰胺與魷魚墨粗多糖對(duì)小鼠小腸上皮細(xì)胞pIgR的mRNA表達(dá)量影響不大。pIgR的蛋白表達(dá)量結(jié)果(Fig 6)與mRNA表達(dá)量基本相似，環(huán)磷酰胺與魷魚墨多糖對(duì)小鼠小腸上皮細(xì)胞pIgR的蛋白表達(dá)量影響不大，但魷魚墨高劑量組的pIgR蛋白表達(dá)量明顯增高(P＜0.05)。

體外純化蛋白和細(xì)胞與組織表達(dá)蛋白的相關(guān)研究表明，人、牛、大鼠、小鼠和兔的pIgR均是高度N－糖基化的，分子中大約有15% ～24%碳水化合物［2］。在高劑量組小鼠中，小腸上皮細(xì)胞pIgR的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平mRNA上沒(méi)有變化而蛋白質(zhì)水平上卻有明顯提高。這可能與魷魚墨多糖影響pIgR的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控如糖基化等過(guò)程有關(guān)。高劑量魷魚墨多糖促使pIgR高表達(dá)，提示魷魚墨多糖對(duì)上皮細(xì)胞功能具有改善作用。另外，pIgR高表達(dá)時(shí)，經(jīng)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)并剪切后在腸腔內(nèi)形成的分泌片(secretory component，SC)也增多，可以發(fā)揮更強(qiáng)的抑制腸道有害菌的作用。

Fig 3 Photographs of small intestine by HE staining

Fig 4 Photographs of IgA expression of small intestine by immunohistochemistry staining

Fig 5 Relative mRNA expression of pIgR in mouse intestine

Fig 6 Expression of pIgR in mouse intestine

3 討論

腸粘膜表面存在大量的微生物，通常外環(huán)境中的大部分病原體進(jìn)入胃腸道后，會(huì)被粘膜天然免疫成分形成的屏障阻止在體外。而腸道分泌的SIgA是腸粘膜免疫的重要免疫屏障，其主要功能是阻抑細(xì)菌、病毒等病原體的粘附，使之不能在腸粘膜表面定植并繁殖，從而防止感染的發(fā)生［8］?；熕幬?、糖皮質(zhì)激素、嚴(yán)重燙傷、吸煙等因素，都可以導(dǎo)致腸粘膜SIgA的減少［9－10］。當(dāng)機(jī)體SIgA分泌能力下降時(shí)，會(huì)引起腸道菌群的失調(diào)、菌群移位、消化吸收障礙等，甚至還會(huì)引起腸炎和腸源性全身感染等情況。此外，臨床上出現(xiàn)部分患者在血清中存在抗食物蛋白的抗體和超敏反應(yīng)發(fā)生率的增加，這與SIgA的分泌下降不能有效阻止食物性抗原經(jīng)腸道入侵有關(guān)［11］。因此，尋找促進(jìn)腸道SIgA分泌的活性物質(zhì)具有重要意義。

環(huán)磷酰胺是一種抗腫瘤的化療藥物，可以導(dǎo)致免疫低下，引起腸道SIgA的減少，適于構(gòu)建SIgA減少的動(dòng)物模型。食物和中藥首先接觸的是胃腸道粘膜免疫，而且?guī)缀鯖](méi)有毒性，成為尋找促進(jìn)SIgA活性物質(zhì)的重要來(lái)源。已有報(bào)道指出:中藥四君子湯復(fù)方的多糖能使環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)小鼠的腸粘膜中IgA+細(xì)胞數(shù)量增加［12］;海帶多糖能夠明顯提高小鼠腸粘膜組織中 SIgA含量，并呈劑量依賴效應(yīng)［13］。魷魚墨多糖具有改善免疫功能低下的作用［7］，但是對(duì)改善腸粘膜SIgA方面的活性尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究的結(jié)果顯示，北太平洋魷魚墨多糖可以明顯改善環(huán)磷酰胺所致免疫功能低下小鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)，初步證實(shí)了魷魚墨多糖對(duì)小鼠具有免疫增強(qiáng)作用。另外，北太平洋魷魚墨多糖可以明顯改善小鼠腸道SIgA的分泌，提示其對(duì)腸道獲得性免疫具有改善作用，并且呈劑量依賴關(guān)系。腸道SIgA的生成依賴于兩種細(xì)胞:分泌IgA和J鏈的漿細(xì)胞，以及表達(dá)pIgR的腸上皮細(xì)胞。本研究結(jié)果表明，魷魚墨多糖可明顯促進(jìn)小鼠腸道SIgA分泌，這與其促進(jìn)漿細(xì)胞分泌IgA增多和促進(jìn)上皮細(xì)胞表達(dá)pIgR相關(guān)。小鼠腸道固有層IgA表達(dá)量增多，上皮細(xì)胞pIgR穿胞轉(zhuǎn)運(yùn)dIgA含量隨之增加，因此分泌到腸腔中的SIgA含量亦會(huì)增加而使腸道粘膜防御功能增強(qiáng)。其中魷魚墨多糖高劑量組小鼠SIgA的明顯升高(P＜0.01)可能還與魷魚墨多糖促進(jìn)上皮細(xì)胞pIgR表達(dá)量增高有關(guān)。本研究為魷魚墨多糖在食品、營(yíng)養(yǎng)保健等領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。

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