新型止血材料纖維蛋白貼的止血作用研究

黃遠鏗，肖百全，歐慧瑜，韓 重，楊 威

(廣州醫(yī)藥研究總院藥物非臨床評價研究中心，廣東廣州 510240)

出血是外科手術(shù)和外傷中最常見、最難控制的問題之一，特別是重要臟器的出血，如肝臟、脾臟、腎臟破裂出血常常直接威脅生命。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全世界因交通事故而死亡的人數(shù)已超過3 000萬人，中國車禍的發(fā)生率和死亡率皆居世界之首位，而內(nèi)臟出血又是車禍較嚴重又常見的癥狀之一。另外，據(jù)美軍的一項調(diào)查發(fā)現(xiàn):陣亡將士中有90%死在被送到醫(yī)院之前，其中1/2死于大出血，1/4在負傷5～10 min內(nèi)就送了命［1］。傳統(tǒng)的止血方式如結(jié)扎、壓迫止血和藥物促凝止血曾經(jīng)拯救過千千萬萬的出血患者，但這些方式也具有較大的缺陷，如結(jié)扎、壓迫止血法僅適合大血管出血，對彌漫性出血控制困難;藥物止血僅能作為輔助手段止血，對內(nèi)臟大出血的直接止血作用有限;此外，止血后殘留在人體腔道內(nèi)的血液容易引起組織粘連等。因此，新型的可吸收的止血材料是止血領(lǐng)域研究的熱點和難點?，F(xiàn)國內(nèi)臨床上用于醫(yī)用止血材料主要有纖維蛋白膠、明膠海綿、氧化纖維素、微纖維膠原、醫(yī)用生物蛋白膠及藻酸鈣纖維等［2］，雖然具備一定的止血效果，但也存在著粘附性一般，容易脫落，用于實質(zhì)性器官大面積創(chuàng)面止血容易被血液沖脫而產(chǎn)生二次出血的風(fēng)險。纖維蛋白貼是我國自行研發(fā)的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的生物制品5類新藥，是一種新型的止血材料，主要由纖維蛋白原、凝血酶、膠原蛋白、核黃素等材料和蛋白骨架組成。其止血作用目前尚未見相關(guān)報道，本課題旨在研究纖維蛋白貼的止血作用，并與臨床上已經(jīng)上市銷售的醫(yī)用生物蛋白膠進行比較，為止血新材料的止血研發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SD大鼠，SPF級，♀♂兼用，180～200 g，90只，從廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心購入。西藏小型豬，普通級，♀♂兼用，8～10 kg，6只，廣州市醫(yī)藥工業(yè)研究所實驗動物研究開發(fā)中心提供。

1.1.2 試劑 戊巴比妥鈉，中國醫(yī)藥(集團)上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品(進口分裝)，規(guī)格，25 g/瓶，批號F20020915。醫(yī)用生物蛋白膠(悅靈膠):杭州普濟醫(yī)藥技術(shù)開發(fā)有限公司生產(chǎn)，批號:20080103，儲存于2℃ ～8℃。

纖維蛋白貼，廣州春榮生物科技有限公司提供，批號:20061210，規(guī)格:(4.8×9.5×0.5)cm，低劑量貼片含藥量為臨床貼片的1/3;使用時先用生理鹽水浸潤，樣品貯存:2℃ ～8℃保存。臨床擬用方案:根據(jù)創(chuàng)面的實際大小確定，一般要求纖維蛋白貼的覆蓋面邊緣離創(chuàng)面邊緣約1 cm。

1.1.3 儀器與設(shè)備 日本Sysmex CA-510凝血儀;賽多利斯 150FE-L、TE4100-L、BP3100S、BS400SWEI型電子天平。

1.2 方法

1.2.1 劑量設(shè)計與給藥方案 大鼠設(shè)計3個纖維蛋白貼劑量組，分別為:纖維蛋白貼高劑量為將3層臨床貼片重疊，纖維蛋白貼中劑量為使用1張臨床應(yīng)用貼片，纖維蛋白貼低劑量為使用1張低劑量貼片，各劑量組使用時根據(jù)傷口大小進行恰當(dāng)裁剪使用。小型豬只設(shè)計1個纖維蛋白貼臨床應(yīng)用貼片組。

1.2.2 SD 大鼠肝創(chuàng)傷面出血試驗［3－4］選用 SD大鼠90只，按體重隨機分成6組，即假手術(shù)組、模型對照組、醫(yī)用生物蛋白膠組、纖維蛋白貼高、中、低劑量組，每組15只。動物先進行造模:大鼠戊巴比妥鈉麻醉后，將腹部毛發(fā)剃除，常規(guī)消毒后在腹部劍突下正中開一2～3 cm切口，暴露肝臟，小心將大鼠肝右葉游離出腹腔，并在肝臟下方放置一塊干凈的紗塊(已消毒稱重)，然后用手術(shù)剪將大鼠肝右葉部分切除，切除肝臟體積約為(1.6×0.7×0.5)cm。大鼠肝右葉部分切除后立即將預(yù)先準(zhǔn)備好纖維蛋白貼(或噴醫(yī)用生物蛋白膠)貼于切口上，貼上時立即計時，觀察出血時間。貼上纖維蛋白貼(或噴上醫(yī)用生物蛋白膠)時用肝臟下方的紗塊輕輕按壓傷口，使纖維蛋白貼(或醫(yī)用生物蛋白膠)與切口粘牢，并可將切口的滲血吸干，待切口不再出血時稱量紗塊的重量即可計算出血量［出血量(ml)=(止血后紗塊重量－止血前紗塊重量)/血液密度］，模型對照組直接用紗塊壓迫止血，待紗布上血印較淡時停止計時，中間時段即為出血時間，若出血時間大于20 min則以20 min計。出血時間及出血量測量完畢后將大鼠腹腔縫合關(guān)閉。假手術(shù)組大鼠打開腹腔后將肝臟暴露后即關(guān)閉腹腔，其它不做任何處理。術(shù)后2天、1周、2周、4周各組動物頸總靜脈采血約1 ml用于檢測給藥后動物凝血功能［5］的變化及腹腔探查腹膜粘連情況。術(shù)后第1周、2周、4周每組分別隨機抽取5只大鼠處死，小心將其腹腔打開，觀察并記錄大鼠腹腔粘連情況，然后剪取大鼠肝損傷創(chuàng)傷面，中性PBS福爾馬林液固定后病理檢測。

1.2.3 西藏小型豬肝、脾臟創(chuàng)面出血試驗［6－7］選用西藏小型豬6只，按體重將隨機分成3組，即模型組、醫(yī)用生物蛋白膠組、纖維蛋白貼組，每組2只。然后將小型豬麻醉后腹腔打開，游離脾臟及肝臟，使其充分暴露，分別對肝臟和脾臟進行創(chuàng)面損傷。損傷標(biāo)準(zhǔn):肝臟做一長約5 cm、寬約2 cm、深約0.5 cm的創(chuàng)面，脾臟做一長約5 cm、寬約2 cm、深約0.5 cm的創(chuàng)面，脾臟和肝臟切開之后，立即進行出血時間及出血量測定，方法同“1.2.2”。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計所有數(shù)據(jù)均輸入SPSS 11.5進行統(tǒng)計分析，各組計量數(shù)據(jù)均計算±s，組間比較采用ANOVA法統(tǒng)計分析。各計量數(shù)據(jù)則進行χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 對SD大鼠肝創(chuàng)傷面出血的影響 試驗結(jié)果表明(Tab 1－3):①纖維蛋白貼高、中、低劑量組均能有效的減少大鼠肝創(chuàng)傷面的出血量及縮短出血時間(P＜0.01)，高、中、低劑量組在減少大鼠肝創(chuàng)傷面出血量方面組間差異，但實驗過程中能觀察到肝創(chuàng)傷面血液剛好能透過低劑量的纖維支架，而不能透過高、中劑量組的纖維支架。在出血時間上，纖維蛋白貼高劑量組出血時間少于中、低劑量組。醫(yī)用生物蛋白膠組也能明顯減少出血量及縮短出血時間(P＜0.01)，試驗過程還觀察到纖維蛋白貼與創(chuàng)傷面結(jié)合緊密，不易分離，而醫(yī)用生物蛋白膠與傷口結(jié)合疏松，很容易脫落導(dǎo)致重新出血。②術(shù)后2 d及給藥后1周、2周、4周，與模型組、假手術(shù)組相比，纖維蛋白貼高、中、低劑量組 PT、APTT、TT、Fbg 均未見明顯差別(P＞0.05)。③對大鼠腹腔臟器粘連的影響:術(shù)后48 h，除假手術(shù)組無粘連外，其余各試驗組大鼠肝創(chuàng)面均與周邊組織發(fā)生粘連。模型組、醫(yī)用生物蛋白膠組、纖維蛋白貼組給藥后1、2周開腹探查及4周后動物末次處理時仍與周邊組織有粘連，但模型組肝創(chuàng)面和藥物及周邊組織粘連緊密，難以分開，纖維蛋白貼各組大鼠肝創(chuàng)面與周邊組織粘連較疏松，而醫(yī)用生物蛋白膠組與周邊組織粘連程度介于兩者之間。④大鼠肝創(chuàng)傷面病理切片結(jié)果可見:纖維蛋白貼各劑量組與醫(yī)用生物蛋白膠組大鼠均未見引起接觸組織病理性的組織學(xué)改變，創(chuàng)面恢復(fù)良好，具體見Fig 1～22。

Tab 1 Amount of bleeding and bleeding time of SD rats’liver affected by Fibrin Patch(±s，n=15)

Tab 1 Amount of bleeding and bleeding time of SD rats’liver affected by Fibrin Patch(±s，n=15)

＊＊P＜0.01 vs model group

Group Dose Amount of bleeding/ml Bleeding time/s Sham － 0 0 Model － 0.54±0.37 644±238 Fibrin glue 1.0 ml 0.17 ±0.13＊＊ 156±71＊＊Fibrin Patch high dose 3 pieces 0.15 ±0.14＊＊ 70±37＊＊Fibrin Patch medium dose 1 piece 0.19 ±0.27＊＊ 139±174＊＊Fibrin Patch low dose 1/3 piece 0.15 ±0.20＊＊ 202±142＊＊

2.2 對西藏小型豬肝、脾創(chuàng)面出血的影響 試驗結(jié)果表明(Tab 5):①與模型組相比，纖維蛋白貼組能明顯減少西藏小型豬肝損傷面的出血量，也能縮短止血時間。醫(yī)用生物蛋白膠組也能減少小型豬肝損傷面的出血量和出血時間。②與模型組相比，纖維蛋白貼組能明顯減少小型豬脾的出血量，也能縮短脾的出血時間。醫(yī)用生物蛋白膠組也能明顯減少小型豬脾臟的出血量及縮短出血時間。③與醫(yī)用生物蛋白膠組相比，纖維蛋白貼組對肝、脾損傷面的出血量和出血時間相近，但試驗過程中能明顯觀察到醫(yī)用生物蛋白膠與肝、脾損傷面結(jié)合不緊密，非常疏松，容易被創(chuàng)傷面血液的壓力沖開或分離，且可見創(chuàng)傷面的血液是從膠體邊緣漏出的，這可能在一定的程度上影響了膠體對創(chuàng)傷面之間的粘度;而纖維蛋白貼與肝、脾創(chuàng)傷面結(jié)合非常緊密，不易脫落，血液是透過其支架滲出的。

Tab 2Blood clotting of SD rats affected by Fibrin Patch(±s)

Tab 2Blood clotting of SD rats affected by Fibrin Patch(±s)

Group PT/s APTT/s d 2 wk 1 wk 2 wk 4 Sham 12.3 ±2.4 11.9 ±0.9 11.8 ±2.9 11.8 ±1.0 20 ±d 2 wk 1 wk 2 wk 4 5 17±2 16±6 15±1 Model 11.3 ±4.5 10.5 ±0.7 11.5 ±2.6 12.0 ±1.0 20 ±4 16 ±2 15 ±4 14 ±3 Fibrin glue 11.1 ±1.3 10.9 ±0.9 12.3 ±1.8 11.8 ±1.2 17 ±3 18 ±6 16 ±4 15 ±2 Fibrin Patch high dose 12.1 ±2.6 11.6 ±1.1 11.2 ±1.2 11.1 ±1.4 18 ±6 16 ±3 15 ±3 14 ±1 Fibrin Patch medium dose 12.4 ±2.5 11.5 ±0.6 11.2 ±1.4 10.2 ±1.3 19 ±7 16 ±3 16 ±3 15 ±2 Fibrin Patch low dose 11.3 ±2.4 11.9 ±1.3 11.5 ±0.6 11.9 ±1.8 19 ±5 15 ±1 16 ±2 15 ±3

Tab 3Blood clotting of SD rats affected by Fibrin Patch(±s)

Tab 3Blood clotting of SD rats affected by Fibrin Patch(±s)

－1 Group TT/s Fbg/g·L d 2 wk 1 wk 2 wk 4 Sham 43 ±10 39 ±2 40 ±1 41 ±4 3.5 ±0.4 2.8 ±0.3 2.6 ±d 2 wk 1 wk 2 wk 4 0.9 2.0 ±0.4 Model 39 ±7 42 ±5 43 ±3 43 ±1 3.4 ±0.4 2.9 ±0.4 2.2 ±0.8 1.9 ±0.2 Fibrin glue 43 ±6 37 ±6 44 ±2 41 ±2 3.5 ±0.4 2.8 ±0.5 2.3 ±0.3 1.9 ±0.1 Fibrin Patch high dose 40 ±7 44 ±5 43 ±3 40 ±2 3.2 ±0.5 2.8 ±0.4 2.4 ±0.7 1.9 ±0.3 Fibrin Patch medium dose 40 ±8 41 ±8 42 ±3 40 ±2 3.5 ±0.4 2.6 ±0.7 2.5 ±0.6 2.0 ±0.3 Fibrin Patch low dose 38±6 39±7 44±5 41±3 3.1±0.4 2.8 ±0.7 2.4 ±0.7 1.9 ±0.4

Fig 1-12 Wound surface of SD rats’liver affected by Fibrin Patch

Tab 4 Amount of bleeding and bleeding time of miniature pigs’liver and spleen affected by Fibrin Patch(±s)

Tab 4 Amount of bleeding and bleeding time of miniature pigs’liver and spleen affected by Fibrin Patch(±s)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs model group

Group n Dose Wound of liver Amount of bleeding(ml)Bleeding time(s)Wound of spleen Amount of bleeding(ml)Bleeding time(s)Model 2 － 4.2±0.7 748±152 46.5±4.1 1200±0 Fibrin glue 2 2－3 ml 2.8±1.0 575±289 8.6±1.1* 561±19＊＊Fibrin Patch dose 2 1 piece 0.7±0.1* 303 ±78 9.2±0.1*649±251

3 討論

纖維蛋白貼主要由纖維蛋白原、凝血酶、膠原蛋白、核黃素等組成，即在膠原蛋白形成的膠原海綿基礎(chǔ)上通過特殊技術(shù)方法加入了纖維蛋白原、凝血酶、核黃素等，臨床擬開發(fā)為內(nèi)臟破裂出血、組織滲血等出血病癥的止血材料。膠原蛋白形成的膠原海綿已有報道［8］具有較好的創(chuàng)面止血作用，其吸附在出血創(chuàng)面，形成一層屏障，能有效地阻擋出血并吸附血小板，誘導(dǎo)血小板激活發(fā)生聚集，形成血小板聚集物，從而啟動一期生理止血機制;纖維蛋白原［9］為凝血因子Ⅰ，凝血酶為活化的凝血因子Ⅱ，常作為藥物用于局部止血，凝血酶能夠促進纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，纖維蛋白形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)包裹血細胞形成血凝塊或微血栓，堵塞出血血管或創(chuàng)傷表面，形成障礙物，可有效地阻止損傷血管繼續(xù)出血，從而減少出血對膠原海綿層的沖力，保證了膠原海綿在創(chuàng)傷表面粘附更為緊密;同時，凝血酶能激活凝血因子Ⅴ、Ⅷ、Ⅺ、ⅩⅢ和血小板［10］，從而正反饋加速凝血。核黃素即維生素B2，具有促進細胞的再生作用，能誘導(dǎo)創(chuàng)面細胞再生，加速創(chuàng)面?zhèn)诘挠吓c恢復(fù)。

為考察纖維蛋白貼在不同物種間，對不同臟器、不同出血情況的止血效果，本研究選用大鼠肝出血模型、小型豬肝脾出血模型進行研究。在大鼠肝臟出血實驗中，纖維蛋白貼各劑量及醫(yī)用生物蛋白膠均能明顯降低大鼠肝創(chuàng)面出血量，縮短出血時間;其中在出血量方面各給藥組未見明顯差異，而在出血時間方面，纖維蛋白貼中、高劑量優(yōu)于醫(yī)用生物蛋白膠。分析各實驗組出血量差別不明顯的原因在于大鼠肝臟較小，創(chuàng)傷面出血量、出血壓力均較小，而各止血材料均具有一定的止血作用，因此，在出血量方面纖維蛋白貼各劑量組和醫(yī)用生物蛋白膠組均未見明顯差別。在小型豬肝脾創(chuàng)面出血實驗中，纖維蛋白貼對脾臟的止血效果與醫(yī)用生物蛋白膠相當(dāng)，而對肝臟的止血效果上，無論是出血量或出血時間均明顯優(yōu)于醫(yī)用生物蛋白膠。且在上述兩實驗中纖維蛋白貼與肝、脾創(chuàng)傷面結(jié)合非常緊密，其形成的膠原海綿纖維支架，能夠承受住出血部位的壓力，不易脫落，從而可避免了產(chǎn)生二次出血的風(fēng)險;對于出血量較多而血液透過其支架滲出的情況，可多層纖維蛋白貼重疊使用進行止血，以達到滿意的止血效果。提示纖維蛋白貼能夠完全包裹住出血創(chuàng)面，既能夠解決創(chuàng)面大出血又能夠控制后續(xù)彌漫性出血情況。醫(yī)用生物蛋白膠作為現(xiàn)在臨床上最常用的醫(yī)藥材料之一，是根據(jù)血液的凝固機制研制而成的藥物，通過噴涂在創(chuàng)面后即可形成一層纖維蛋白凝膠，粘附在創(chuàng)面上而達到止血作用，同時其所形成的凝膠具有一定的機械強度和粘合力，能減少傷口張力并促進愈合，但容易與其它組織的粘連等副作用［11］。本研究中觀察到醫(yī)用生物蛋白膠與肝、脾等創(chuàng)面結(jié)合不緊密，疏松，容易被創(chuàng)傷面血液的壓力沖開或分離，具有引起二次出血的風(fēng)險，且可見創(chuàng)傷面的血液是從膠體邊緣漏出的，這在一定的程度上影響了膠體對創(chuàng)傷面之間的粘度，也是膠體容易脫落的原因(見Fig 17、22)。實驗結(jié)果還表明，纖維蛋白貼各劑量組實驗動物全身凝血功能與同期假手術(shù)組相比未見明顯改變，表明纖維蛋白貼只對出血局部的凝血功能產(chǎn)生作用，未引起全身性的凝血抗凝平衡的改變。纖維蛋白貼組肝創(chuàng)面模型大鼠術(shù)后4周時創(chuàng)面恢復(fù)良好，對機體未見病理性的組織學(xué)損傷，與周邊組織粘連較疏松，在組織粘連方面優(yōu)于醫(yī)用生物蛋白膠，可能為纖維蛋白貼能夠有效止血，減少血液進入腹腔，同時膠原海綿纖維支架作為一層生物膜，能有效阻止周圍結(jié)締組織直接與創(chuàng)面接觸，從而達到預(yù)防和減少組織粘連的作用，而核黃素促進了肝創(chuàng)面細胞再生，從而有效促進肝創(chuàng)面的愈合。此外，纖維蛋白貼還具有使用方便簡單等優(yōu)點，臨用時用生理鹽水浸泡后或直接張貼于創(chuàng)傷面即可，對于野外危險作業(yè)和軍事戰(zhàn)爭具有良好的保障。

Fig 13-22 Amount of bleeding of miniature pigs’liver and spleen affected by Fibrin Patch

綜上所述，纖維蛋白貼具有良好的止血作用，對大鼠和小型豬臟器破損出血模型具有良好的止血作用，且可預(yù)防二次出血及減少組織粘連，止血作用強大但不影響機體全身的凝血功能，其總體效果優(yōu)于醫(yī)用生物蛋白膠。是一種新型的非常理想的創(chuàng)面局部止血材料，具有巨大的應(yīng)用價值、社會效益及軍事戰(zhàn)備意義，值得進一步研究開發(fā)。

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