苦參堿改構(gòu)體X調(diào)控Caspase-3，Caspase-8和Caspase-9蛋白表達(dá)誘導(dǎo)人鼻咽癌CNE1凋亡的研究

陳 俊，唐安洲，梁 鋼，王立升，謝 貌，張 俊

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科，廣西南寧 530021;2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧 530001;3.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧 530021;4.廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西 南寧 530004)

苦參堿(Matrine)是一類具有多方面藥理活性的生物堿。近年來，發(fā)現(xiàn)該藥物在抑制腫瘤生長、殺傷和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等研究中表現(xiàn)出明顯活性［1－4］。有報道表明苦參堿對鼻咽癌也有一定的抑制作用［5－7］，能夠引起人鼻咽癌 CNE2細(xì)胞的增殖抑制和凋亡增加，并對Caspase途徑有激活作用［7］。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)由苦參堿改構(gòu)合成的苦參堿改構(gòu)體X(14-噻吩基次亞甲基苦參堿，F(xiàn)ig 1)具有強(qiáng)于苦參堿體外抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖的作用，且對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞無損傷［8］，這種特性使得改構(gòu)體X有望成為一種新型的抗鼻咽癌藥物。本研究旨在前期研究工作基礎(chǔ)上，將改構(gòu)體X體外作用于人鼻咽癌細(xì)胞CNE1，觀察其對CNE1細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響，并對Caspase蛋白家族中具有代表性的凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測，以探討其抗鼻咽癌的作用機(jī)制，為開發(fā)抗鼻咽癌的治療藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 人鼻咽癌細(xì)胞株CNE1于中南大學(xué)湘雅中心實驗室所購得，本實驗室接種保存。培養(yǎng)條件為:含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)。

1.2 藥物與試劑 苦參堿和苦參堿改構(gòu)體X由廣西大學(xué)王立升教授提供和協(xié)助合成，單體純度＞98%;藥物用DMEM培養(yǎng)液稀釋，過濾除菌，4℃保存。順鉑(DDP)注射液，南京制藥廠有限公司;DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清，Hyclone公司;胰蛋白酶，GIBCO公司;PBS，Sigma公司;細(xì)胞裂解液，上海碧云天公司;一抗抗兔Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG，Proteintech group公司;內(nèi)參GAPDH，上?？党缮镉邢薰?。

1.3 儀器 CKX41倒置顯微鏡(Olympus)，－80℃超低溫冰箱(Forma)，58108高速冷凍離心機(jī)(Eppendorff)，2300型 CO2培養(yǎng)箱(Shellab)，H-7650型透射電鏡(日立)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與給藥 將CNE1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1×105U·L－1青霉素和1×105U·L－1鏈霉素的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，定期觀察，用2.5 g·L－1胰蛋白酶聯(lián)合0.02%EDTA消化傳代。

將對數(shù)生長期的CNE1接種于6孔培養(yǎng)板中，接種密度為每孔3×105個，生長至80%以上融合度時，分別加入低、中、高劑量(29、58、116 μmol·L－1)的苦參堿改構(gòu)體X，另設(shè)空白DEME培養(yǎng)細(xì)胞作為陰性對照組、DDP 組(6.67 μmol·L－1)及苦參堿組(7 258 μmol·L－1，為實驗測試出的苦參堿對 CNE1 48 h的IC50)。處理時間為48 h。

1.5 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察 分別收集作用CNE1細(xì)胞48 h后的苦參堿改構(gòu)體X各劑量組、DDP組、苦參堿組與陰性組各1 ml，PBS洗3次，預(yù)冷的2%戊二醛4℃固定2 h以上，1%鋨酸后固定1.5 h后，酒精及丙酮逐級脫水，環(huán)氧樹脂包埋，作0.5 μm切片，醋酸雙氧鈾及枸椽酸鉛染色，透射電鏡觀察照相。

1.6 Western blot檢測 Caspase-3，Caspase-8 和Caspase-9蛋白的表達(dá) 分別收集作用CNE1細(xì)胞48 h后的苦參堿改構(gòu)體X各劑量組、DDP組、苦參堿組與陰性組，0.01 mol·L－1預(yù)冷 PBS洗細(xì)胞3次，加入含有5 μl PSMF 的 RIPA 緩沖液500 μl冰上裂解細(xì)胞30 min;然后4℃、12 000×g離心15 min;取上清，BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量測定蛋白濃度，后與SDS-PAGE蛋白緩沖液按照比例混合，煮沸5 min，立即分裝，置 －20℃?zhèn)溆?。?5 μg蛋白上樣，SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，分別檢測Caspase-3，-8和-9的表達(dá)水平，GAPDH作為內(nèi)參。對目的條帶灰度值進(jìn)行半定量分析，取目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值比值為相對表達(dá)量。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行方差分析，LSD檢驗兩組間差異。

2 結(jié)果

2.1 透射電鏡觀察藥物對CNE1細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響 透射電鏡下，陰性對照組細(xì)胞具有癌細(xì)胞的一般特征，細(xì)胞核大，核仁清晰，核邊界明顯，細(xì)胞核稍有內(nèi)陷，常染色質(zhì)多，異染色質(zhì)少，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)比值大，細(xì)胞內(nèi)無退變的細(xì)胞器，細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)密度均勻(Fig 2，F(xiàn));苦參堿改構(gòu)體 X各劑量組作用CNE1 48 h后，細(xì)胞呈凋亡的形態(tài)，細(xì)胞皺縮，核內(nèi)異染色質(zhì)明顯增多，核周隙增大，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)充滿大小不等空泡，凋亡小體形成，線粒體空泡變性，有電子致密顆粒沉積，細(xì)胞表面微絨毛變粗變短，數(shù)量減少甚至消失，細(xì)胞膜基本完整，高劑量較中低劑量凋亡程度更加明顯(Fig 2，A、B、C);苦參堿組細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)邊集，電子密度增加，部分線粒體增生，水腫，嵴模糊不清，出現(xiàn)大量自噬體，未見明顯凋亡小體(Fig 2，D);DDP組細(xì)胞大片壞死，部分凋亡指征，細(xì)胞結(jié)構(gòu)溶解 (Fig 2，E)。

2.2 Western blot檢測 Caspase-3，-8和-9蛋白表達(dá)的結(jié)果 苦參堿改構(gòu)體X作用CNE1細(xì)胞48 h后，各劑量組細(xì)胞內(nèi)Caspase-3，-8，-9的含量均有不同程度升高，具一定的劑量依賴性;Fig 3顯示，與對照組相比，改構(gòu)體X不同劑量組及DDP組處理后的Caspase-3明顯增加，苦參堿組的Caspase-3明顯增加;對于Caspase-8，低劑量改構(gòu)體X與對照組差異無顯著性，其他處理組均與對照組差異有顯著性(Fig 4);高劑量改構(gòu)體X組的Caspase-9表達(dá)增加量最高，各處理組均與對照組差異有顯著性(Fig 5)。Fig 6顯示 Caspase-3、Caspase-8與 Caspase-9 3種蛋白在不同處理下的表達(dá)差異。

Fig 4 Effect of derivant X of the matrine on the expression of Caspase-8(±s，n=3)

3 討論

Fig 5 Effect of derivant X of the matrine on the expression of Caspase-9(±s，n=3)

Fig 6 Expression of Caspase-3，Caspase-8 and Caspase-9 induced by derivant X of the matrine

本課題組前期研究工作中已發(fā)現(xiàn)，苦參堿經(jīng)化學(xué)改構(gòu)后的化合物(苦參堿改構(gòu)體X)對人鼻咽癌CNE2細(xì)胞增殖有體外抑制作用，其48h的IC50值為(106.378 ±0.825)mg·L－1，低于苦參堿對CNE2 細(xì)胞的 IC50值 710 mg·L－1［8］;課題組通過MTT實驗法檢測出苦參堿和苦參堿改構(gòu)體X對人鼻咽癌細(xì)胞CNE1細(xì)胞48 h的IC50分別為7 258、126 μmol·L－1(結(jié)果另文發(fā)表)，可見改構(gòu)體 X 能抑制兩種人鼻咽癌細(xì)胞的生長，且作用強(qiáng)于其先導(dǎo)化合物苦參堿。

本研究設(shè)置不同劑量組改構(gòu)體X處理CNE1細(xì)胞，通過透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，苦參堿改構(gòu)X處理組的腫瘤細(xì)胞皺縮，核內(nèi)異染色質(zhì)明顯增多，核周隙增大，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)充滿大小不等空泡，同時可找到類圓形的凋亡小體形成，其改變有別于壞死，苦參堿7 258 μmol·L－1劑量下電鏡下也出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，但未見明顯凋亡小體，提示改構(gòu)體X在低于其先導(dǎo)化合物苦參堿的60多倍的劑量下即可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其誘導(dǎo)凋亡的作用可能是體外抑制CNE1增殖的機(jī)制之一。

Caspase-8是作為外源性凋亡途徑中的上游蛋白，可剪切激活下游凋亡執(zhí)行蛋白包括Caspase-3、-6、-7［9－10］，繼而導(dǎo)致細(xì)胞走向凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，改構(gòu)體X高劑量組與苦參堿組作用48h后Caspase-8的表達(dá)量相當(dāng)(Fig 4);與對照組相比，苦參堿組、苦參堿改構(gòu)體X中、高劑量組Caspase-8的表達(dá)明顯上調(diào)，差異具有顯著性;結(jié)果提示，苦參堿和改構(gòu)體X均可激活細(xì)胞凋亡的外部途徑的上游蛋白Caspase-8，有可能通過外部途徑的激活起到誘導(dǎo)CNE1細(xì)胞凋亡的作用。胞質(zhì)蛋白凋亡活化因子-l(Apaf-l)可通過Caspase補(bǔ)充結(jié)構(gòu)域與Caspase-9前體的原結(jié)構(gòu)域結(jié)合，導(dǎo)致Caspase-9自身剪切活化，活化的Caspase-9進(jìn)一步激活其下游Caspase-3、-6、-7，誘導(dǎo)細(xì)胞從內(nèi)部途徑走向凋亡［11－12］。本實驗對Caspase-9表達(dá)檢測中發(fā)現(xiàn)，苦參堿改構(gòu)體X低、中、高劑量組與苦參堿組可使CNE1細(xì)胞內(nèi)Caspase-9表達(dá)明顯升高(P＜0.01);提示改構(gòu)體X對細(xì)胞凋亡的內(nèi)部途徑也有激活作用，與苦參堿表現(xiàn)出類似作用。Caspase-3是內(nèi)外兩條凋亡途徑的共同執(zhí)行蛋白，許多凋亡因子最終都是作用于下游效應(yīng)器Caspase-3起到促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用［13］。試驗結(jié)果顯示，苦參堿改構(gòu)體X低、中、高劑量組作用后可使CNE1細(xì)胞內(nèi)Caspase-3表達(dá)明顯升高(P＜0.01)，提示改構(gòu)體X可能是通過激活凋亡的內(nèi)外途徑中的上游蛋白Caspase-8、9，從而起到激活下游的凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3而產(chǎn)生促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。改構(gòu)體X保留了先導(dǎo)化合物上調(diào)促凋亡蛋白表達(dá)的作用機(jī)制，而且上調(diào)表達(dá)能力更強(qiáng)，增多了誘導(dǎo)人鼻咽癌細(xì)胞凋亡途徑，對于是否可通過其他凋亡機(jī)制參與誘導(dǎo)調(diào)亡有待進(jìn)一步研究。

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