CaMKⅡ信號(hào)通路在黃芪多糖抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大中的作用

張 靜，王洪新，楊 娟，魯美麗，李勝陶，喻曉春

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院 遼寧省心腦血管藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧，錦州 121001;2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，北京 100700)

心肌肥厚(myocardial hypertrophy)是心臟對(duì)體內(nèi)外各種刺激產(chǎn)生的一種適應(yīng)性反應(yīng)，隨著疾病的進(jìn)展，最終可導(dǎo)致心力衰竭［1］。β腎上腺素能受體是調(diào)節(jié)心臟功能的主要受體，其在心臟中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制一直是研究的熱點(diǎn)，β受體興奮后導(dǎo)致炎癥因子的活化，并且涉及多種心血管疾病［2］。研究發(fā)現(xiàn)異丙腎上腺素(Iso)誘導(dǎo)心肌肥厚的過(guò)程中涉及炎癥反應(yīng)，使機(jī)體炎癥因子如白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等含量增加［3］。有證據(jù)表明黃芪多糖(astragalus polysaccharides，APS)具有一定的抗炎作用，可明顯減少脂多糖誘導(dǎo)的人單核細(xì)胞株THP21中IL-6的表達(dá)及分泌［4］。本實(shí)驗(yàn)室已證明:① Iso可激活CaMKⅡ 信號(hào)通路誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大［5］，② APS對(duì)Iso誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大具有一定的保護(hù)作用［6］，其APS的劑量是本實(shí)驗(yàn) APS的參考依據(jù)。然而APS是否通過(guò)抑制CaMKⅡ信號(hào)通路保護(hù)心肌及CaMKⅡ在Iso誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大所致炎癥反應(yīng)中的作用，目前尚無(wú)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用 10 μmol·L－1的Iso為誘導(dǎo)劑［7］，進(jìn)一步探討APS對(duì)Iso誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、藥品和試劑 出生1～3天的SD乳鼠，♀♂不拘，由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(遼)2003－0007。黃芪多糖為陜西森弗生物技術(shù)有限公司，批號(hào):HQ090312，純度98%;Iso、PRO、二甲基亞砜(DMSO)﹑十二烷基硫酸鈉(SDS)﹑CaMKⅡ抑制劑KN93均購(gòu)自美國(guó)sigma公司;低糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司;小牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司;RT-PCR試劑盒、引物、Marker均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司;CaMKⅡδ一抗購(gòu)自Santa Cruz;IL-6、TNF-α ELISA 試劑盒購(gòu)自 R＆D公司;其他試劑均為分析純。

1.2 體外乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng) 體積分?jǐn)?shù)為0.75的乙醇消毒，無(wú)菌開(kāi)胸，迅速取出心臟，置于盛有D-Hanks溶液培養(yǎng)皿中清洗，修剪心臟僅留心尖部分并剪成大小約為0.5～1.0 mm3的碎塊，加入0.8 g·L－1胰蛋白酶溶液，37℃分次恒溫消化，第一次10 min，棄上清，以后均為8 min，消化4～5次。將消化好的細(xì)胞置于體積分?jǐn)?shù)為0.15小牛血清、0.84低糖DMEM和0.01雙抗(含濃度均為100 U·L－1的青霉素和鏈霉素)吹打均勻后，裝入25 cm2培養(yǎng)瓶(或24孔培養(yǎng)板)中，37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)。采用差速貼壁法純化心肌細(xì)胞，然后將細(xì)胞調(diào)至所需密度(培養(yǎng)瓶為5×106，培養(yǎng)板為5×105)置于孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 分組及給藥方法 常規(guī)培養(yǎng)心肌細(xì)胞48 h后，為減少血清成分對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，更換體積分?jǐn)?shù)為0.0004小牛血清的低糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞生長(zhǎng)周期同步化后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)所需藥品Iso、APS和PRO均為水溶性，三蒸水溶解后0.22 μm針式濾器除菌;KN93溶于DMSO，為消除DMSO對(duì)心肌細(xì)胞的毒性作用，其在培養(yǎng)基中的體積分?jǐn)?shù)需小于0.001。給藥組APS、KN93和PRO預(yù)先孵育30 min，加入Iso，48 h后進(jìn)行各指標(biāo)的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)共分為 8 組:①正常對(duì)照組;②Iso(10 μmol·L－1);③KN93(0.2 μmol·L－1);④Iso+KN93;⑤Iso+APS(0.1 mg·L－1);⑥Iso+APS(1 mg·L－1);⑦Iso+APS(10 mg·L－1);⑧Iso+PRO(2 μmol·L－1)。

1.4 心肌細(xì)胞體積的測(cè)定 取“1.3”處理的各組細(xì)胞，PBS快速?zèng)_洗長(zhǎng)滿(mǎn)細(xì)胞的培養(yǎng)孔，每孔加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1% 的胰蛋白酶，放入37℃ 恒溫箱中孵育10 min左右，隨后每孔加入含體積分?jǐn)?shù)為0.1×102血清的培養(yǎng)基終止消化。將同組細(xì)胞合并收集注入一細(xì)胞室內(nèi)(該細(xì)胞室底部是一經(jīng)硅化的蓋玻片，防止心肌細(xì)胞貼壁)，在放大400倍的倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，幾乎呈球形。用計(jì)算機(jī)CIAS大恒細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)測(cè)量單個(gè)細(xì)胞的直徑，進(jìn)而計(jì)算出細(xì)胞的體積。每孔隨機(jī)選擇4個(gè)視野，每個(gè)視野測(cè)20個(gè)細(xì)胞。

1.5 心肌細(xì)胞總蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 取“1.3”處理的各組細(xì)胞，吸去各孔中的培養(yǎng)液，PBS溶液沖洗3次，加入SDS使細(xì)胞裂解，為減少去垢劑對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，SDS的含量應(yīng)低于0.01%。根據(jù)計(jì)數(shù)，每孔細(xì)胞數(shù)約為5×105個(gè)，采用 Bradford法測(cè)定細(xì)胞的總蛋白含量。

1.6 ELISA法檢測(cè)心肌細(xì)胞外液IL-6和TNF-α的含量 取“1.3”處理的各組細(xì)胞上清液，將試劑盒置于室溫平衡30 min，按照ELISA試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，完畢后在全自動(dòng)酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)讀取吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)各標(biāo)本吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上得出相應(yīng)的濃度。

1.7 RT-PCR法檢測(cè)心肌細(xì)胞 ANP mRNA的表達(dá) 收集“1.3”處理的各組細(xì)胞，加入 TRIzol試劑800 μl裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解液，氯仿抽提，異丙醇沉淀，用DEPC處理水回收總RNA。以質(zhì)量濃度為10 g·L－1的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)A260/A280鑒定RNA濃度和純度，純度以大于1.8為宜。取約1 μg總 RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄條件為:30℃ 10 min;45℃ 30 min;95℃ 5 min。ANP 引物:up:5'-GGGCTCCTTCTCCATCAC-3'，down:5'-CCCTCAGTTTGCTTTTCA-3'(348 bp);內(nèi)參GAPDH的引物序列為:up:5'-AATGCATCCTGCCACCACCAACTGC-3'，down:5'-CCAGGCCATGTAGTAGGCCATGAGGTC-3'(550 bp)。PCR反應(yīng)條件:94℃45 s，55℃ 50 s，72 ℃ 1 min 15 s。循環(huán)擴(kuò)增結(jié)束后，取10 μl產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量濃度為20 g·L－1的瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)束后，置于凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察和分析。

1.8 Western blot法測(cè)心肌細(xì)胞 CaMKⅡδ蛋白水平 收集“1.3”處理的各組細(xì)胞，BCA法蛋白定量。保證上樣量相同條件下計(jì)算出每組應(yīng)吸取樣品上清的體積，用上樣緩沖液補(bǔ)至 80 μl，再加 100 μl溴酚藍(lán)染液煮沸4 min，然后各取10 μl樣品以及蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)樣，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。初始電壓為90 V，觀察 Marker的移動(dòng)情況，適時(shí)終止電泳。轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜，然后取所需部分與稀釋過(guò)的一抗(1∶1 000)4℃雜交過(guò)夜，第2日用 TBST洗膜3次，然后室溫與二抗作用至少1 h，再次洗膜3次，加ECL顯色，上機(jī)檢測(cè)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)均以±s表示，采用單因素方差分析和LSD法。

2 結(jié)果

2.1 APS對(duì)心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變的影響 Fig 1顯示，在倒置相差顯微鏡下觀察，正常對(duì)照組心肌細(xì)胞呈梭形、三角形和不規(guī)則形，有突起，呈放射狀排列;Iso組細(xì)胞較為飽滿(mǎn)且明顯肥大，可見(jiàn)少量細(xì)胞碎片;KN93組(CaMKⅡ抑制劑 )細(xì)胞形態(tài)與正常對(duì)照組無(wú)明顯差異;Iso+KN93組和Iso+不同濃度黃芪多糖組均對(duì)肥大的心肌細(xì)胞有一定的改善作用，表現(xiàn)為細(xì)胞體積變小，細(xì)胞碎片減少，且黃芪多糖從低劑量(0.1 mg·L－1)、中劑量(1 mg·L－1)到高劑量組(10 mg·L－1)，保護(hù)作用依次增強(qiáng)，呈劑量依賴(lài)性。

2.2 APS對(duì)心肌細(xì)胞體積及蛋白含量的影響Tab 1顯示，與正常對(duì)照組相比，Iso組心肌細(xì)胞體積增大了88.3%，總蛋白含量增加了55.3%;KN93組細(xì)胞體積和總蛋白含量未見(jiàn)明顯改變，提示CaMKⅡ的抑制劑對(duì)正常心肌細(xì)胞無(wú)影響;與Iso組相比，Iso+KN93組、Iso+PRO組和黃芪多糖低、中、高劑量組心肌細(xì)胞體積分別減小了45.2%、44.7%、27.6%、35.2%、45.2%，細(xì)胞總蛋白含量分別降低了 33.9%、33.4%、13.5%、25.0%、34.7%;提示KN93組、PRO組和APS低、中、高劑量組均可對(duì)Iso誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大產(chǎn)生一定的抑制作用，且APS存在劑量依賴(lài)性。

Fig 1 Pictures of the cultured neonatal rat cardiomyocytes(×400)

Tab 1 Effects of different treatments on cell size and total protein content of cultured myocardial cells induced by Iso［±s，n=80(size)，n=6(protein)］

Tab 1 Effects of different treatments on cell size and total protein content of cultured myocardial cells induced by Iso［±s，n=80(size)，n=6(protein)］

＊＊P＜0.01 vs normal group;##P＜0.01 vs Iso;□P＜0.05 vs APS 0.1 mg·L－1;△P＜0.05 vs APS 1 mg·L－1

Group Cell size/μm3 Protein/μg(in 5 ×105cells Normal 1170 ±112 17.15 ±1.1 Iso 10 μmol·L －1 2204 ±167＊＊ 26.63 ±1.6＊＊KN93 0.2 μmol·L －1 1181 ±141 17.28 ±1.1 Iso+KN93 1208 ±139## 17.59 ±1.3##Iso+APS 0.1 mg·L －1 1597 ±189## 23.03 ±1.7##Iso+APS 1 mg·L －1 1428 ±144##□ 19.98 ±2.7##□Iso+APS 10 mg·L －1 1203 ±116##△ 17.39 ±1.5##△Iso+PRO 2 μmol·L －1 1218 ±156## 17.72 ±1.5##)

2.3 APS對(duì)心肌細(xì)胞外液中IL-6和TNF-α表達(dá)的影響 Tab 2顯示，與正常對(duì)照組相比，Iso組心肌細(xì)胞外液中IL-6的含量增加了65.9%，且TNF-α含量的增加大于100%;KN93組細(xì)胞外液中IL-6和TNF-α的含量未見(jiàn)明顯改變;與Iso組相比，Iso+KN93組、Iso+PRO組和黃芪多糖低、中、高劑量組中IL-6和TNF-α的含量均明顯較少，且APS存在劑量依賴(lài)性;提示 APS可以減少炎癥因子 IL-6和TNF-α的釋放，保護(hù)心肌。

Tab 2 Effects of different treatments on expression of IL-6 and TNF-α in cultured myocardial cells induced by Iso(±s，n=6)

Tab 2 Effects of different treatments on expression of IL-6 and TNF-α in cultured myocardial cells induced by Iso(±s，n=6)

＊＊P＜0.01 vs normal group;##P＜0.01 vs Iso;□P＜0.05 vs APS 0.1 mg·L－1;△P ＜0.05 vs APS 1 mg·L－1

Group IL-6/ng·L－1 TNF-α/ng·L －1 Normal 131.2 ±1.9 22.8 ±2.9 Iso 10 μmol·L－1 217.7 ±6.8＊＊ 68.4 ±4.7＊＊KN93 0.2 μmol·L－1 138.4 ±2.8 25.3 ±2.3 Iso+KN93 141.7 ±1.8## 27.2 ±1.6##Iso+APS 0.1 mg·L －1 185.2 ±4.2## 36.4 ±3.3##Iso+APS 1 mg·L －1 163.7 ±4.7##□ 29.4 ±3.9##□Iso+APS 10 mg·L－1 140.0 ±2.4##△ 26.8 ±2.3##△Iso+PRO 2 μmol·L －1 143.9 ±3.2## 28.4 ±3.4##

2.4 APS對(duì)心肌細(xì)胞ANP mRNA表達(dá)的影響Tab 3和Fig 2顯示，與正常對(duì)照組相比，Iso組心肌細(xì)胞ANP mRNA的表達(dá)明顯增高了46.9%;KN93組ANP mRNA的表達(dá)未見(jiàn)明顯改變;與Iso組相比，Iso+KN93組、Iso+PRO組和黃芪多糖低、中、高劑量組ANP mRNA的表達(dá)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;表明KN93組、PRO組、黃芪多糖組均對(duì)Iso誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大有一定的抑制作用，提示阻斷CaMKⅡ信號(hào)通路可能對(duì)心肌有保護(hù)的作用。

2.5 APS對(duì)心肌細(xì)胞CaMKⅡδ蛋白表達(dá)的影響

Tab 4和Fig 3顯示，與正常對(duì)照組相比，Iso組CaMKⅡδ蛋白表達(dá)明顯增高了;KN93組蛋白表達(dá)未見(jiàn)明顯改變;與Iso組相比，Iso+KN93組、Iso+PRO組和黃芪多糖低、中、高劑量組CaMKⅡδ蛋白表達(dá)均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;提示黃芪多糖可能通過(guò)抑制CaMKⅡ信號(hào)通路的激活，從而達(dá)到保護(hù)心肌的作用。

Fig 2 Effects of different treatments on ANP mRNA expression of cultured neonatal rat cardiomyocytes

Tab 3 Effects of different treatments on ANP mRNA expression of cultured myocardial cells induced by Iso(±s，n=4)

Tab 3 Effects of different treatments on ANP mRNA expression of cultured myocardial cells induced by Iso(±s，n=4)

＊＊P＜0.01 vs normal group;##P＜0.01 vs Iso;□P＜0.05 vs APS 0.1 mg·L－1;△P ＜0.05 vs APS 1 mg·L－1

Group ANP mRNA(IA ANP/IA GAPDH)Normal 1.021 ±0.028 Iso 10 μmol·L－1 1.922 ±0.085＊＊KN93 0.2 μmol·L－1 1.029 ±0.017 Iso+KN93 1.141 ±0.038##Iso+APS 0.1 mg·L －1 1.406 ±0.159##Iso+APS 1 mg·L －1 1.211 ±0.097##□Iso+APS 10 mg·L－1 1.047 ±0.153##△Iso+PRO 2 μmol·L －1 1.351 ±0.172##

Tab 4 Effects of different treatments on CaMKⅡδ expression of cultured myocardial cells induced by Iso(±s，n=4)

Tab 4 Effects of different treatments on CaMKⅡδ expression of cultured myocardial cells induced by Iso(±s，n=4)

＊＊P＜0.01 vs normal group;##P＜0.01 vs Iso;□P＜0.05 vs APS 0.1 mg·L－1;△P ＜0.05 vs APS 1 mg·L－1

Group A CaMKⅡδ/A β-actin Normal 0.61 ±0.02 Iso 10 μmol·L－1 0.94 ±0.05＊＊KN93 0.2 μmol·L－1 0.63 ±0.01 Iso+KN93 0.65 ±0.02##Iso+APS 0.1 mg·L －1 0.81 ±0.06##Iso+APS 1 mg·L －1 0.72 ±0.08##□Iso+APS 10 mg·L－1 0.64 ±0.06##△Iso+PRO 2 μmol·L －1 0.67 ±0.05##

Fig 3 Effects of different treatments on CaMKⅡδ expression of cultured neonatal rat cardiomyocytes

3 討論

心肌肥厚是心臟對(duì)各種病理性刺激產(chǎn)生的一種適應(yīng)性生理反應(yīng)。最初，可能是心臟為適應(yīng)正常的室壁應(yīng)力和保持收縮功能，但這種適應(yīng)過(guò)程可能逐步發(fā)展為擴(kuò)張型心肌病、心肌纖維化、心律失常、心力衰竭甚至猝死［8］。研究發(fā)現(xiàn)［9］，心肌肥厚過(guò)程中，肥厚基因的表達(dá)增高，且有炎癥因子的過(guò)度表達(dá)。Serra等［10］研究發(fā)現(xiàn)，Iso誘導(dǎo)的心肌肥厚中TNF-α和IL-6的表達(dá)水平增高，運(yùn)動(dòng)療法使促炎性因子明顯減少，改善心肌收縮力，抑制左心室肥厚，防止心室重塑，保護(hù)心肌。因此，炎癥在心肌肥厚中的作用是不能忽視的。

CaMKⅡ是一種普遍存在的、多效性的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在心臟中以 δ亞型為主［11］。CaMKⅡ通過(guò)與鈣化的鈣調(diào)蛋白(Ca2+/CaM)結(jié)合，使其抑制性結(jié)構(gòu)域移位，發(fā)生自動(dòng)磷酸化而被激活［12］。研究發(fā)現(xiàn)［13］，持續(xù)的心肌損傷通過(guò)激活CaMKⅡ信號(hào)通路，使促炎基因表達(dá)，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)生心肌肥厚，因此，CaMKⅡ可以作為連接心肌肥厚和炎癥信號(hào)通路的樞紐。實(shí)驗(yàn)表明，抑制CaMKⅡ的活性可以減少心肌肥厚、防止功能性重構(gòu)及心律失常的發(fā)生［14］。Singh 等［15］發(fā)現(xiàn)，在野生型大鼠后壁心肌梗死模型中，CaMKⅡ被氧化激活，肥厚的標(biāo)志性基因的表達(dá)上調(diào)，促炎基因如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、補(bǔ)體因子 B(Cfb)的含量明顯增多，并且發(fā)生心肌細(xì)胞壞死和心肌纖維化。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Iso處理的心肌細(xì)胞體積增大、總蛋白含量增多及ANP mRNA的表達(dá)增高，表明肥大模型成功;APS和CaMKⅡ阻斷劑KN93均可明顯減少上述表現(xiàn)，除此之外，均可使CaMKⅡδ蛋白的表達(dá)降低，且APS的劑量越大，效果越明顯，呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)性，提示阻斷CaMKⅡ可降低ANP mRNA的表達(dá)，抑制心肌肥厚;同時(shí)APS可通過(guò)阻斷CaMKⅡ有效抑制Iso誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Iso處理的心肌細(xì)胞外液中IL-6和TNF-α的含量增加，APS和CaMKⅡ阻斷劑KN93均可減少炎癥因子IL-6和TNF-α的釋放，APS在此亦呈劑量依賴(lài)性，提示APS通過(guò)阻斷CaMKⅡ抑制炎癥因子的產(chǎn)生。故APS可以通過(guò)阻斷CaMKⅡ信號(hào)通路減少炎癥因子的產(chǎn)生，抑制炎癥反應(yīng)和心肌細(xì)胞肥大，從而保護(hù)心肌。

眾多研究表明，心肌肥厚的過(guò)程中涉及CaMKⅡ的激活和炎癥反應(yīng)，但APS是否可以通過(guò)減少炎癥反應(yīng)阻斷CaMKⅡ達(dá)到保護(hù)心肌的作用，目前尚不清楚，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究黃芪多糖對(duì)CaMKⅡ信號(hào)通路的影響，進(jìn)一步深入研究心肌肥厚的可能機(jī)制和中國(guó)傳統(tǒng)中藥黃芪的保護(hù)作用，為心肌肥厚等心血管疾病的防治提供新思路。黃芪多糖抑制心肌肥厚的過(guò)程中，是否涉及其它通路及是否與CaMKⅡ信號(hào)通路存在交互作用有待于進(jìn)一步的研究。

［1］Jaiswal A，Kumar K，Seth S，et al.Effect of U50，488H，a к-opioid receptor agonist on myocardial α-and β-myosin heavy chain expression and oxidative stress associate with isoproterenol-induced cardiac hypertrophy in rat［J］.Mol Cell Biochem，2010，345(1 － 2):231－40.

［2］汪 熠.β-腎上腺素能受體信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥因子在心肌損傷中的作用［J］.國(guó)際心血管雜志，2008，35(2):69 －72.

［2］Yi W.Effect of inflammatory factors involve β-adrenergic receptor signaling pathway in myocardial injury［J］.Int J Cardiovasc Dis，2008，35(2):69 －72.

［3］Murray D R，Prabhu S D，Chandrasekar B.Chronic β-adrenerigic stimulation induces myocardial proinflammatory cytokine expression［J］.Circulat，2000，101(20):2338 － 41.

［4］郭進(jìn)強(qiáng)，覃 旻，羅炳德.黃芪多糖對(duì)脂多糖誘導(dǎo)人THP21單核細(xì)胞MCP-1與IL-6表達(dá)的影響［J］.分子診斷與治療雜志，2012，4(4):258 －61.

［4］Guo J Q，Qin M，Luo B D.Effects of astragulus polysaccharide on the monocyte chemoattractant protein-1 and interleukin-6 expression induced by lipopolysaccharide in human THP21 mononuclear cells［J］.Mol Diagn Ther，2012，4(4):258 － 61.

［5］Wu G Q，Wang H X，Yang J，et al.κ-Opioid receptor stimulation inhibits augmentation of Ca2+transient and hypertrophy induced by isoprenaline in neonatal rat ventricular myocytes—Role of CaMKIIδB［J］.Eur J Pharmacol，2008，595(1 －3):52 －7.

［6］趙素玲，王洪新，周振華，等.黃芪多糖對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的乳大鼠心肌細(xì)胞肥大的保護(hù)作用［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2011，27(12):1682－6.

［6］Zhao S L，Wang H X，Zhou Z H，et al.Protective effects of astragalus polysaccharides on isoproterenol induced myocardial hypertrophy in neonatal rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(12):1682－6.

［7］魯美麗，王洪新，張 蕾，等.鈣調(diào)磷酸酶信號(hào)通路參與 κ-受體激動(dòng)對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的乳大鼠心肌細(xì)胞肥大的抑制作用［J］.中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2010，24(3):180 －4.

［7］Lu M L，Wang H X，Zhang L，et al.Participation of calcineurin signal pathways in inhibitory effects of κ-opioid receptor stimulation on myocardical hypertrophy induced by isoprenaline in neonatal rats［J］.Chin J Pharmacol Toxicol，2010，24(3):180 －4.

［8］Shen E，Diao X，Wei C，et al.MicroRNAs target gene and signaling pathway by bioinformatics analysis in the cardiac hypertrophy［J］.Biochem Biophy Res Commun，2010，397(3):380 －5.

［9］Rosenkranz S，F(xiàn)lesch M，Amann K，et al.Alterations of β-adrenergic signalling and cardiac hypertrophy in transgenic mice overexpressing TGF-β1［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2002，283(3):H1253－62.

［10］Serra A J，Santos M H，Bocalini D S，et al.Exercise training inhibits inflammatory cytokines and more than prevents myocardial dysfunction in rats with sustained β-adrenergic hyperactivity［J］.J Physiol，2010，588(Pt13):2431 －42.

［11］Grimm M，Ling H，Brown B H.Crossing signals:relationships between β-adrenergic stimulation and CaMKⅡ activation［J］.Heart Rhythm，2011，8(8):1296 －8.

［12］Yoo B，Lemaire A，Mangmool S，et al.Betal-adrenergic receptors stimulate cardiac contractility and CaMKⅡactivationin vivoand enhance cardiac dysfunction following myocardial infarction［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2009，297(4):H1377 －86.

［13］Singh M V，Anderson M E.Is CaMKⅡa link between inflammation and hypertrophy in heart［J］?J Mol Med，2011，89(6):537 －43.

［14］Bányász T，Szentandrássy N，Tóth A，et al.Cardiac calmodulin kinase:a potential target for dug design［J］.Curr Med Chem，2011，18(24):3707－13.

［15］Sihgh M V，Swam inathan P D，Luczak E D，et al.MyD88 mediated inflammatory signaling leads to CaMKⅡoxidation，cardiac hypertrophy and death after myocardial infarction［J］.J Mol Cell Cardiol，2012，52(5):1135 －44.