杜仲葉酶解液輔助提高醋抗氧化活性的研究

賈春鳳，王 松，戎柯曉，孫曉琦，郝建新，周 方，伏邦炳，干蘇靈，張柏林，*

（1.北京林業(yè)大學(xué)生物科技學(xué)院，北京100083；2.保定學(xué)院生化系，河北保定071000；3.陜西明冠食品飲料有限公司，陜西略陽724300；4.江蘇綠揚現(xiàn)代生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，江蘇揚州225105）

醋具有較好的抗氧化作用。Shoko Nishidai等[1]研究了醋的抗氧化活性（亞油酸自氧化體和DPPH體系），黑醋的乙酸乙醋萃取物（EK）的抗氧化活性最高。Atsushi Sugiyama等[2]研究表明，一定劑量的葡萄醋和葡萄汁可以降低小鼠心臟病和高血壓的發(fā)病率。杜仲（Eucommia ulmoides Oliver）為杜仲科（Eucommiace-ae）植物，一般以皮入藥，在我國具有悠久使用歷史。近期研究發(fā)現(xiàn)，杜仲葉中含有的化學(xué)成分和杜仲皮中的極為相似，并且二者具有相近藥理作用[3-4]，且杜仲葉資源豐富易得。因此，杜仲葉作為食品加工原料，在食品中的應(yīng)用已經(jīng)進(jìn)入起步階段，目前市場上主要產(chǎn)品有杜仲茶，但應(yīng)用到食品中的深加工研究卻鮮有報道。杜仲葉中綠原酸含量相當(dāng)豐富，綠原酸具有較強(qiáng)的生物活性[5]，其中最主要的是抗氧化作用[6]。張萬峰[7]研究表明，杜仲葉綠原酸（CA）含量為1.27%-4.06%。鑒于《中華人民共和國藥典》將綠原酸定為評價杜仲葉質(zhì)量優(yōu)劣的主要技術(shù)指標(biāo)[8]，因此本研究以綠原酸為標(biāo)志物質(zhì)對杜仲葉酶解液的抗氧化活性進(jìn)行探究。許多疾病的發(fā)生被認(rèn)為與氧化有關(guān)，如冠心病、癌癥、糖尿病等[9-11]，從而抗氧化物質(zhì)的研究已經(jīng)成為目前科研領(lǐng)域的熱門課題。生物材料的抗氧化特性可能是不同抗氧化劑相互作用的結(jié)果，表現(xiàn)為協(xié)同作用、負(fù)協(xié)同作用、累加效應(yīng)[12-13]。本實驗將研究杜仲葉酶解液和醋協(xié)同抗氧化作用，為功能性食品的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杜仲葉 陜西省漢中市略陽縣秋季老葉；鎮(zhèn)江香醋 醋酸＞4.00g/100mL，江蘇丹陽市恒君調(diào)味品廠；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品 色譜純，上海融禾醫(yī)藥科技有限公司；纖維素酶 分析純，九州同業(yè)藥品公司；VC分析純，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-Picrylhydrazyl radical，DPPH） 分析純，Sigma公司；三氯乙酸（TCA）、95%的乙醇、硫酸亞鐵、過氧化氫、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等 均為北京化工廠產(chǎn)分析純。

752型紫外可見分光光度計 上海美諾達(dá)儀器有限公司；分析天平 上海民析精密科學(xué)儀器有限公司；DSY-2-8型恒溫水浴鍋 北京國華醫(yī)療器械廠。

1.2 杜仲葉酶解液（EEH）的制備

綠原酸（CA）標(biāo)準(zhǔn)品用95%的乙醇稀釋一系列的梯度，在332nm測定吸光值，繪制曲線，建立方程y=0.0505x+0.0037（R2=0.9995）。式中：x為溶液中綠原酸質(zhì)量濃度（0～60μg/mL）；y為吸光值。

在酶解溫度為45℃，料液比為1∶10，酶添加量為0.1%，酶解時間2h的條件下，對杜仲葉粉進(jìn)行酶解，酶解液過膜，并用紫外分光光度計在332nm下測定綠原酸含量。

1.3 杜仲葉酶解液與醋配比方案

以文獻(xiàn)[14-15]中提到的杜仲葉酶解液（EEH）抗氧化活性為依據(jù)，以杜仲葉酶解液中綠原酸含量為指標(biāo)，按不同的體積比進(jìn)行實驗設(shè)計（見表1）。

表1 不同樣品的配比Table 1 Different ratio of eucommia ulmoides oliv leaves enzymatic hydrolysate and vinegar

1.4 抗氧化性能研究方法

1.4.1 清除DPPH自由基性能測定 方法在文獻(xiàn)[16-20]的基礎(chǔ)上略做修改。DPPH溶液的配制：準(zhǔn)確稱取4mg DPPH，用適量95%乙醇溶解，然后定容至100mL，得DPPH濃度0.004%，4℃避光保存。配制不同濃度的樣品溶液，同一試管中加入1mL樣品溶液，1mL 0.004%DPPH溶液，搖勻，室溫放置30min。95%乙醇代替樣品做為空白對照。測定各溶液517nm的吸光度。重復(fù)3～5次，然后按以下公式計算清除率，清除率越大則抗氧化能力越強(qiáng)。

清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/A0]×100

式中：A0——1mL無水乙醇加入1mL DPPH溶液的吸光值；Ai——1mL樣品中加入1mL DPPH溶液反應(yīng)后在517nm處的吸光度；Aj——1mL待測液加1mL 95%乙醇的吸光值。

1.4.2 還原能力的測定 方法在文獻(xiàn)[1，19-20]的基礎(chǔ)上略作調(diào)整。按1.3得的各樣品分別配制成20μL/mL的待測樣品溶液備用。待測樣品2mL，與2mL磷酸緩沖液（0.2moL/L，pH6.6），2mL 1%K3Fe（CN）6混合，將混合物于50℃溫育25min，然后在混合物中加入2mL 10%三氯乙酸。取上層清液5mL，加入5mL水和lmL 0.1%三氯化鐵，混合均勻，靜置10min后以蒸餾水為空白，700nm下測定吸光值A(chǔ)700。

1.4.3 羥自由基的清除率測定 方法以參考文獻(xiàn)[1，2，20]為基礎(chǔ)并加以改進(jìn)。具體操作如下：按1.3得的各樣品分別配制成20μL/mL的待測樣品溶液備用。1mL待測樣品中加入6.0mmol/L的水楊酸乙醇溶液（用純乙醇配制）1mL，再加入6.0mmol/L的硫酸鐵溶液1mL，用蒸餾水補(bǔ)足4mL，混勻后加入6.0mmol/L的過氧化氫溶液1mL啟動Fenton反應(yīng)，搖勻，放置10min后，以蒸餾水作參比，在510nm下測定吸光值。

羥自由基的清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/A0]×100

式中：Ai—空白對照溶液于510nm下的吸光值；Aj—1mL蒸餾水代替水楊酸，按同法進(jìn)行Fenton反應(yīng)，在510nm下的吸光值；A0—1mL蒸餾水代替樣品，按同法進(jìn)行Fenton反應(yīng)，在510nm下的吸光值。

1.5 數(shù)據(jù)分析及處理

每組實驗重復(fù)5次，采用SPSS 17.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行T檢驗和相關(guān)性分析，實驗結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。采用Sigmaplot 10.0軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶解液中綠原酸含量

測得杜仲葉酶解液中綠原酸含量為（1.80±0.16）mg/mL。

2.2 杜仲葉酶解液的抗氧化性能研究

2.2.1 酶解液清除DPPH自由基能力研究 圖1顯示，隨著物質(zhì)含量的增加，各樣品都呈現(xiàn)出先快速上升后逐漸趨于平穩(wěn)的抗氧化活性趨勢，說明反應(yīng)液中樣品的含量達(dá)到一定值后，再增加物質(zhì)含量已對樣品抗氧化性沒有影響。當(dāng)物質(zhì)含量在5～10μg/mL時，與CA標(biāo)品、VC標(biāo)品相比，EEH酶解液清除DPPH自由基的能力較強(qiáng)，這可能因為EEH酶解液中還含有黃酮等其他高抗氧化活性物質(zhì)。在10μg/mL時，酶解液的DPPH的清除率達(dá)到最高值，為88.70%±0.91%。因此，酶解液應(yīng)用到食品時，其綠原酸含量不能低于10μg/mL。

圖1 VC、CA、EEH清除DPPH自由基能力Fig.1 DPPH free radical-scavenging activity of VC，CA and EEH

2.2.2 酶解液清除羥自由基能力研究 圖2顯示，隨著物質(zhì)含量的增加，各樣品除羥自由基能力呈現(xiàn)上升趨勢。物質(zhì)含量為10μg/mL時，EEH、VC和CA清除羥自由基能力幾乎同時達(dá)到最高，清除率分別為：47.5510%±1.37%、49.42%±0.94%、28.85%±0.96%，可見酶解液具有較強(qiáng)清除羥自由基能力并且遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于綠原酸標(biāo)品，這也可能是酶解液中還含有黃酮其他高抗氧化活性物質(zhì)所致。當(dāng)樣品含量大于10μg/mL，隨著樣品含量的增加，酶解液清除羥自由基的能力逐漸平緩。因此，在實際應(yīng)用時綠原酸添加量最好保持在10μg/mL以上，以保證其效果的穩(wěn)定性。

圖2 VC、CA、EEH清除羥自由基能力Fig.2Hydroxyl（OH）radical-scavenging activity of EEH，VCand CA

2.2.3 酶解液還原能力研究 圖3顯示，隨著物質(zhì)含量的增加，各樣品還原能力呈現(xiàn)上升趨勢。與VC和CA標(biāo)品比較，EEH酶解液還原能力較弱。但當(dāng)物質(zhì)含量為0.2mg/mL時，VC和CA還原能力已經(jīng)呈現(xiàn)平穩(wěn)的趨勢，而EEH還是上升的趨勢。因此可以推測得出，當(dāng)EEH的含量繼續(xù)增加，大于0.3mg/mL，還原能力會繼續(xù)增加，直至出現(xiàn)平穩(wěn)的趨勢。

圖3 VC、CA、EEH的還原能力Fig.3 Reducing power of EEH，VCand CA

2.3 酶解液和醋協(xié)同抗氧化性能研究

2.3.1 各種樣品清除DPPH自由基能力比較 圖4可見五種樣品清除DPPH自由基的能力強(qiáng)弱順序為：EEH＞EV19＞EV19對照＞EV9＞EV9對照。EEH酶解液清除DPPH自由基活性最強(qiáng)，顯著高于除EV19的其他樣品（p＜0.05）。EV9對照樣品清除DPPH自由基活性最弱，顯著低于其他各個樣品（p＜0.05）。

圖4 不同樣品清除DPPH自由基的能力Fig.4 DPPH free radical-scavenging activity of different sample

2.3.2 各種樣品還原能力比較 樣品還原能力的強(qiáng)弱可用OD值的大小表示，因此由圖5可知，當(dāng)體積含量為20μL/mL時，各個樣品還原能力的強(qiáng)弱順序為EV19＞EV19對照＞EV9＞EV9對照＞EEH，兩個配制樣品EV9、EV19的還原能力分別顯著高于EEH以及各自的對照。

圖5 不同樣品的還原能力Fig.5 Reducing power of different sample

2.3.3 各種樣品清除羥自由基能力比較 不同樣品清除羥自由基能力見圖6。清除羥自由基能力強(qiáng)弱順序為：EV19＞EEH＞EV19對照＞EV9＞EV9對照，可見，EEH的添加能夠提高醋清除羥自由基的能力，配制杜仲醋清除羥自由基能力與添加EEH相關(guān)，杜仲酶解液和醋具有協(xié)同清除羥自由基的作用。

圖6 不同樣品清除羥自由基能力Fig.6 Hydroxyl radical-scavenging activity of different sample

由表2可知，兩種配制樣品（EV9和EV19）的抗氧化活性分別與EEH、醋抗氧化活性的相關(guān)系數(shù)較大，可見，EEH和醋對杜仲醋的抗氧化活性影響較強(qiáng)，共同增強(qiáng)了杜仲醋的抗氧化能力。因此，EEH與醋具有協(xié)同抗氧化作用，EEH能夠輔助提高醋的抗氧化性能。

表2 成對樣本相關(guān)系數(shù)Table 2 Correlation coefficient of paired samples

3 結(jié)論

3.1 杜仲葉酶解液中CA含量為（1.80±0.16）mg/mL。通過體外抗氧化實驗得出，杜仲葉酶解液具有較強(qiáng)的抗氧化性能；當(dāng)酶解液應(yīng)用到食品時，產(chǎn)品中綠原酸含量不得小于10μg/mL。

3.2 杜仲葉酶解液和醋具有較好協(xié)同抗氧化作用，杜仲葉酶解液能夠顯著提高醋的抗氧化活性（p＜0.05），為杜仲葉在食品中的應(yīng)用提供了新的理論支持。

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