肉制品中沙門氏菌invA基因實時熒光定量PCR檢測方法的建立

杜雄偉，李 葉，冮 潔，胡文忠，武曉松

（1.大連民族學院，遼寧大連116600；2.遼寧出入境檢驗檢疫局，遼寧大連116001）

沙門氏菌是一種重要的食源性致病菌。由沙門氏菌引起的食物中毒事件在世界各國頻頻報道。2007年2月，美國發(fā)生的“花生醬事件”，2005～2006年間，美國發(fā)生的“番茄事件”均是因沙門氏菌引發(fā)[1-3]。2006年盧森堡公國，沙門氏菌引起133人食物中毒，1人死亡[4]。2005年6～10月之間，澳大利亞塔斯馬尼亞州爆發(fā)了5次沙門氏菌引起的食物中毒，感染125人[5]。2005年法國因牛奶引起的沙門氏菌中毒事件，同時感染100多嬰兒[6]。1990～2003年間西班牙加泰羅尼亞地區(qū)，共爆發(fā)1078次食物中毒，其中因沙門氏菌引起為871次，14695人感染，1534人住院治療，4人死亡，所占比例高達80.8%[7-9]。在我國，細菌性食物中毒中有70%～80%是由沙門氏菌引起的，以沙門氏菌引起的食物中毒占細菌性食物中毒的首位[10]。由上可見，食品行業(yè)沙門氏菌的檢測尤為重要，現(xiàn)有檢測方法主要為生化鑒定和常規(guī)PCR方法，這些方法耗時耗力，熒光定量PCR方法具有快速準確、敏感性強的特點。國外已經開發(fā)了類似的快速檢測試劑盒，但由于知識產權的限制，使用起來極為不便，并且費用昂貴。因此自主建立特異、敏感、快速的沙門氏菌快速檢測方法對沙門氏菌防控顯得尤為重要。實時熒光定量PCR以其特異性強、靈敏度高、速度快，在病原菌檢測中得到廣泛應用。本研究以沙門氏菌invA基因為靶基因，應用SYBR Green熒光定量PCR技術建立特異快速的沙門氏菌檢測方法，為沙門氏菌的檢測奠定基礎[11-12]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙門氏菌C77-31 購于中國獸藥監(jiān)察所；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌 本實驗室分離保存；野生型鼠白血病病毒反轉錄酶（Reverse Transcriptase M-MLV）、RNA酶抑制劑（Ribonuclease Inhibitor，Rnasin）、Dnase-1、Ex-TaqDNA聚合酶（Ex-Taq Polymerase）、Taq DNA聚合酶（5U/μL）、dNTPs（100mmol/mL）、DL2000 DNA marker、Light Cycler2 FastStart DNA master SYBR GreenⅠ試劑盒、一對特異性引物InvAF、InvAR寶生物工程（大連）有限公司產品；質?？焖偬崛≡噭┖屑癉NA純化試劑盒 Omega公司產品；總RNA提取TRIZOL Reagentinvitrigen公司產品；常規(guī)試劑 均為分析純。

7500型實時熒光定量PCR儀、ABI System 9700型常規(guī)PCR擴增儀 美國ABI公司；凝膠成像分析系統(tǒng) 美國UVP GelDoc-lt公司；高速離心機 美國Eppendorf公司；恒溫搖床 美國Barnstead Lab-Line公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物的設計 根據GenBank中已經注冊的沙門氏菌invA基因序列，用引物設計軟件Prmier5.0設計一對特異性引物InvAF、InvAR，引物序列如下：

InvAF：5’-TCATTCCATTACCTACCTATC-3’

InvAR：5’-AGAA（G/A）ACAACAAAACCCAC-3’

1.2.2 PCR模板的制備 所有受試菌接種于3mL LB肉湯中，37℃培養(yǎng)至OD600為0.5，再調節(jié)細菌濃度為1×107CFU/mL，取1mL，10000r/min離心2min，收集菌體。菌體用滅菌超純水洗滌，1000×g離心5min，棄上清，用200μL的滅菌超純水重懸菌體，加入等體積的消化緩液及5μL的蛋白酶K（20mg/mL），50℃消化2h，12000r/min離心15min；將上清轉移到新的1.5mL的eppendorf管中，加入等體積的Tris飽和酚，緩慢顛倒均勻，12000r/min離心15min；取上層的水相轉入新的1.5mL的eppendorf管中，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）混勻后，在離心機上12000r/min離心15min；酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）重復抽提一次；取上層的水相轉入新的1.5mL的eppendorf管中，加入2倍體積預冷的無水乙醇，在-20℃放置l～2h或室溫放置30min以沉淀細菌DNA；12000r/min離心15min，棄去上清，用70%乙醇洗滌沉淀，自然風干。用含RNAseA（20μg/mL）的TE溶解沉淀，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 常規(guī)PCR（25μL PCR）反應體系 10×PCR buffer（含Mg2+）2.5μL，dNTP（2.5mmol/μL）0.5μL，InvAF（20pmol/μL）0.5μL，InvAR（20pmol/μL）0.5μL，1.2.2.1產物0.5μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，DEPC水20μL；反應程序為94℃，2min；98℃ 15s，54℃15s，72℃ 30s，30個循環(huán)；72℃ 10min。取5μL PCR產物1%于瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.4 標準陽性模板的制備 將1.2.2.2中PCR產物回收純化后，插入pMD18-T載體，命名為pMD18-T-invA，轉化于DH5α大腸桿菌中，PCR、測序鑒定。

1.2.5 標準曲線的建立 20μL反應體系，SYBR GreenⅠ10μL，DryII 0.4μL，InvAF（20pmol/μL）0.4μL，InvAR（20pmol/μL）0.4μL，1.2.2.1產物 2.0μL，無菌三蒸水6.8μL；反應程序為95℃ 2min；95℃ 15s，58℃ 20s，72℃ 30s，80℃ 35s，30個循環(huán)；95℃ 15s，60℃ 2min，95℃15s。反應結束后，ABI7500型熒光定量PCR擴增儀自動記錄結果。

將正確的重組的標準參照物（質粒）以10倍的倍比關系作一系列稀釋，以不同稀釋濃度的標準參照物作為模板，用所設計的引物進行熒光定量PCR擴增，以濃度的對數(shù)和相應的閾值循環(huán)數(shù)（Threshold cycle，Ct）為相應的X軸、Y軸制作標準曲線。

1.2.6 特異性檢測 用所設計的invA引物對沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的純培養(yǎng)物菌液的基因組DNA進行熒光定量PCR，以驗證所選引物的特異性。反應條件同1.2.3。

1.2.7 敏感性檢測 取沙門氏菌培養(yǎng)液，作10倍比稀釋，瓊脂平板培養(yǎng)計數(shù)法測定濃度，并取不同濃度稀釋液，進行熒光定量PCR擴增，確定檢測下線測定。

1.2.8 重復性檢測

1.2.8.1 組內重復性 對同一樣本DNA設置20管，同時上機進行熒光PCR重復性的檢測。

1.2.8.2 組間重復性 重組質粒10倍遞增稀釋樣本檢測后置于-20℃保存30d后重新進行熒光PCR檢測。

2 結果與分析

2.1 沙門氏菌invA基因PCR擴增與測序

常規(guī)PCR（圖1）中明顯可見約188bp大小片段，結果與預期大小一致，PCR擴增產物連接在pMD18-T載體上，命名為pMD18-T-invA。

圖1 invA基因PCR擴增電泳圖Fig.1 The electrophoretogram of PCR amplification of invA gene

擴增片段測序結果為：TCATTCCTTACCTACCTA TCTGGTTGATTTCCTGATCGCACTGAATATCGTACT GGCGATATTGGTGTTTATGGGGTCGTTCTACATTGA CAGAATCCTCAGTTTTTCAACGTTTCCTGCGGTACT GTTAATTACCACGCTATTTCGTCTGGCATTATCGAT CAGTACGAGGAGGTGGTGGGGTTTGT。

2.2 invA基因熒光定量標準曲線的建立

2.2.1 擴增動力學曲線 將invA基因重組質粒以10倍的倍比關系作一系列稀釋，當重組質粒DNA稀釋度在10-2～10-8時，具有較好的線性關系，10-3、10-4、10-5、10-6四濃度摸板擴增后的動力學曲線見圖2。

圖2 invA基因擴增動力學曲線Fig.2 Amplification curve of invA

2.2.2 invA基因熒光定量標準曲線 圖3中，橫坐標為各基因重組質粒梯度稀釋對應拷貝數(shù)的對數(shù)值，縱坐標為達到熒光域值所需的反應循環(huán)數(shù)即閾值循環(huán)數(shù)（Threshold cycle，Ct）。invA基因重組質粒的標準曲線為：y=-3.24x+32.73，相關系數(shù)r2分別為0.9981，標準曲線斜率為-3.24。

圖3 invA基因標準曲線Fig3 Standard curve of invA

2.3 熒光定量PCR的特異性

對沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌進行熒光PCR檢測，只有沙門氏菌出現(xiàn)特異性擴增，其他相關病原（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌）并未有擴增，表明本方法特異性良好。

2.4 熒光定量PCR的敏感性

瓊脂平板培養(yǎng)計數(shù)法測定沙門氏菌培養(yǎng)液濃度，10倍梯度稀釋，取不同濃度稀釋液，進行熒光定量PCR擴增，結果顯示其檢測下線為101CFU/mL。

2.5 熒光定量PCR的重復性

2.5.1 組內重復性 對同一樣本設置20管重復同時檢測，結果見表1，CT值變異系數(shù)為0.96%。說明組內重復性良好。

表1 組內重復性實驗Table 1 Repeatability test in the group

2.5.2 組間重復性 隔30d檢測同一樣本10倍稀釋后檢測，結果見表2，經成對數(shù)據平均數(shù)比較假設檢驗，無顯著差異（p≤0.01）。

表2 組間重復性實驗Table 2 Repeatability test between groups

3 結論與討論

引物直接影響到方法的特異性與靈敏度。由于invA基因較長，具有許多重復序列，為引物的設計增加了難度。為了保證該方法的特異性，從GenBank上下載了大量invA基因序列，通過文獻及序列比較，設計了該基因的引物。為保證方法的靈敏度和擴增效率，獲得檢測最低Ct值和最高熒光強度值，在前期對熒光定量PCR方法Mg2+濃度、引物、探針濃度和Tm溫度優(yōu)化的基礎上，本研究建立了檢測肉制品中沙門氏菌的熒光定量PCR方法，同時也進行了一步熒光定量PCR實驗。

本研究建立了一種快速、敏感、準確檢測肉制品中沙門氏菌的SYBR Green實時熒光定量PCR方法。該方法從核酸提取至檢測完成，僅需3h左右，且實行完全閉管式操作，從根本上杜絕了常規(guī)PCR擴增產物污染和假陽性的問題。經過大量的臨床驗證表明，該檢測方法敏感、特異，操作方便簡單，花費時間短，適用于臨床樣品的檢測。今后的研究方向應放在用酶顆粒代替各種酶成分[13-14]，該方法特異敏感，避免了再污染，具有廣闊的臨床應用前景。

[1]Centers for Disease Control and Prevention（CDC）.Multistate outbreaks of Salmonella infections associated with raw tomatoes eaten in restaurants-United States，2005-2006[J].MMWR Morb Mortal Wkly Rep，2007，56（35）：11-909.

[2]LY KT，CASANOVA JE.Mechanisms of Salmonella entry into host cells.Cell[J].Microbiol，2007，9（9）：11-2103.

[3]MAJTAN J，MAJTANOVA L，XU M，et al.In vitro effect of subinhibitory concentrations of antibiotics on biofilm formation by clinical strains of Salmonella enterica serovar Typhimurium isolated in Slovakia[J].J Appl Microbiol，2008，104（5）：301-1294.

[4]MOSSONG J，MARQUES P，RAGIMBEAU C，et al.Outbreaks of monophasic Salmonella enterica serovar in Luxembourg[J].Euro Surveill，2007，12（6）：2-E11.

[5]STEPHENS N，SAULT C，F(xiàn)IRESTONE SM，et al.Large outbreaks of Salmonella Typhimurium phage type 135 infections associated with the consumption of products containing raw egg in Tasmania[J].Commun Dis Intell，2007，31（1）：24-118.

[6]TOYOFUKU H，KUBOTA K，MORIKAWA K.Outbreaks of Salmonella in infants associated with powdered infant formula[J].Kokuritsu Iyakuhin Shokuhin Eisei Kenkyusho Hokoku，2006，（124）：9-74.

[7]DOMINGUEZ A，TORNER N，RUIZ，et al.Foodborne Salmonella-caused outbreaks in Catalonia（Spain），1990 to 2003[J].J Food Prot，2007，70（1）：13-209.

[8]DOUBLET B，WEILL FX，F(xiàn)ABRE L，et al.Variant Salmonella genomic island 1 antibiotic resistance gene cluster containing a novel 3’-N-aminoglycoside acetyltransferase gene cassette，aac（3）-Id，in Salmonella enterica serovar newport[J].Antimicrob Agents Chemother，2004，48（10）：12-3806.

[9]EAVES DJ，RANDALL L，GRAY DT，et al.Prevalence of mutations within the quinolone resistance-determining region of gyrA，gyrB，parC，and parE and association with antibiotic resistance in quinolone-resistant Salmonella enterica[J].Antimicrob Agents Chemother，2004，48（10）：5-4012.

[10]王茂起，冉陸，王竹天，等.2001年中國食源性致病菌及其耐藥性主動監(jiān)測研究.衛(wèi)生研究[J].2004，33（1）：49-54.

[11]GULIG PA.Virulence plasmids of Salmonella typhimurium and other Salmonellae[J].Microb Pathog，1990，8（1）：3-11.

[12]HACK CJ.Integrated transcriptome and proteome data：the challenges ahead[J].Brief Funct Genomic Proteomic，2004，3（3）：9-212.

[13]STEPHENS N，SAULT C，F(xiàn)IRESTONE SM，et al.Large outbreaks of Salmonella Typhimurium phage type 135 infections associated with the consumption of products containing raw egg in Tasmania[J].Commun Dis Intell，2007，31（1）：24-118.

[14]JACKSON EE，ERTEN ES，MADDI N，et al.Detection and enumeration of four foodborne pathogens in raw commingled silo milk in the United States[J].J Food Prot.2012，75（8）：93-1382.