保加利亞乳桿菌產(chǎn)酸關(guān)鍵酶的研究

孫懿琳，方 偉，田 輝，霍貴成

（乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150030）

酸牛乳在正常發(fā)酵結(jié)束后和食用前這一過程中，乳中的乳酸菌仍能繼續(xù)生長，不斷代謝乳糖產(chǎn)酸，導(dǎo)致酸度增加，使產(chǎn)品出現(xiàn)過酸味及其他感官質(zhì)量下降的現(xiàn)象，表現(xiàn)出后酸化現(xiàn)象（postacidification）[1-2]。目前有采用新霉素誘變保加利亞乳桿菌篩選出H+-ATPase突變型酸敏感菌株來控制后酸化，也有采用基因突變的方法使影響β-半乳糖苷酶的基因缺失和β-半乳糖苷酶下游基因缺失，篩選弱后酸化突變菌株來降低后酸化，目前丹麥漢森公司已研制出高溫條件下產(chǎn)酸能力強(qiáng)、低溫條件下發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸能力較弱的發(fā)酵劑，這正是理想的發(fā)酵劑；其實(shí)對(duì)于酸奶后酸化的研究除了要從酸奶的結(jié)構(gòu)入手外，最有效的方法是從分子生物學(xué)角度上控制乳酸菌發(fā)酵乳糖的代謝機(jī)制，因?yàn)榈率先闂U菌保加利亞亞種是導(dǎo)致后酸化的主要菌株，此菌株貯存后期大量產(chǎn)酸與其大量代謝乳糖和葡萄糖密切相關(guān)，其中，乳糖經(jīng)β-半乳糖苷酶催化，產(chǎn)生葡萄糖和半乳糖，葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑生成乳酸和能量；而半乳糖不被利用，被排除細(xì)胞外[3-4]，其中，控制乳酸菌糖代謝的關(guān)鍵則是控制各個(gè)代謝路徑的關(guān)鍵酶。菌株KLDS1.1006和KLDS 1.1011為本實(shí)驗(yàn)室篩選出的弱后酸化菌株，但其弱后酸化機(jī)理目前還不是很清楚，菌株也沒有投入生產(chǎn)使用，故本實(shí)驗(yàn)的主要目的就是從控制菌株KLDS1.1006和KLDS 1.1011發(fā)酵乳糖代謝路徑的關(guān)鍵酶入手，通過對(duì)H+-ATPase、β-半乳糖苷酶、乳酸脫氫酶及蛋白酶的測定，找出導(dǎo)致其弱后酸化的根本原因，從而為直投式弱后酸化酸奶發(fā)酵劑的制備提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株KLDS1.1006、KLDS1.1011 為篩選出的天然弱后酸化保加利亞乳桿菌；菌株KLDS1.0207 為篩選出的后酸化較強(qiáng)的保加利亞乳桿菌；菌株KLDS1.1015 為從商業(yè)發(fā)酵劑分離的弱后酸化保加利亞乳桿菌，后兩株均作為對(duì)照菌株；MRS培養(yǎng)基、11%（w·v-1）脫脂乳培養(yǎng)基、BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒 購自碧云天公司；NADH、ONPG 購于Sigma公司；SDS、β-巰基乙醇等其他化學(xué)試劑 均為分析純。

Delta 320精密pH計(jì) Mettler Toledo公司；680型酶標(biāo)儀 美國伯樂；DU-800紫外分光光度計(jì) Beckman公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 H+-ATPase活性的測定

1.2.1.1 透性細(xì)胞的制備 按照Ongol等[5]的方法制備透性細(xì)胞，對(duì)其中部分步驟進(jìn)行了修改。

1.2.1.2 H+-ATPase酶活力的測定 細(xì)胞膜粗提取物中蛋白質(zhì)的定量采用BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒檢測。H+-ATPase酶的活性用U·mg-1蛋白質(zhì)來表示[5-7]。

1.2.2 β-半乳糖苷酶活性的測定

1.2.2.1 胞內(nèi)酶的提取 采用溶菌酶破壁法提取胞內(nèi)酶[8]。

1.2.2.2 β-半乳糖苷酶活性的測定 采用ONPG比色法測定β-半乳糖苷酶酶活力。一個(gè)酶活力單位（U）定義為在 37℃條件下，每分鐘釋放1μmol ONPG所需要的酶量[9]。

1.2.3 乳酸脫氫酶活性的測定[10]

式中：V總為反應(yīng)總體積，mL；V樣為樣品體積，mL；△OD340nm為每分鐘光密度的降低值。

1.2.4 蛋白酶活性的測定[11]用蛋白水解力（總游離氨基酸量）反映蛋白酶活力。蛋白水解力測定采用OPA試劑法。

2 結(jié)果與分析

2.1 H+-ATPase酶活力的測定

圖1 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Protein standard curve

采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測得牛血清白蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。由圖1可知蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.9942，說明本標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性程度較高，可用于測定H+-ATPase活性過程中蛋白含量。

磷標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，在無機(jī)磷酸鹽濃度為0.03～0.27mmol/L的范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)為0.9982，可見本標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性程度較高，可用于H+-ATPase活性測定過程中無機(jī)磷酸鹽含量的定量。

圖2 磷濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Phosphorus concentration standard curve

H+-ATPase酶對(duì)調(diào)節(jié)保加利亞乳桿菌的能量代謝[12-13]，增強(qiáng)細(xì)胞的耐酸性[14]，促進(jìn)乳酸菌營養(yǎng)物質(zhì)的吸收（糖、氨基酸等）和代謝物質(zhì)（檸檬酸、乳酸）的輸出[15]以及菌株自身的生長及其穩(wěn)定性都有重要作用，幾乎所有的乳桿菌都含有H+-ATPase酶。保加利亞乳桿菌具有很強(qiáng)的產(chǎn)酸能力和耐酸性，這主要是H+-ATPase酶活的作用，當(dāng)乳酸菌糖酵解產(chǎn)生乳酸導(dǎo)致外界pH降低時(shí)，胞內(nèi)pH也在降低，這時(shí)菌體細(xì)胞處于酸性環(huán)境中，就會(huì)影響其正常的新陳代謝[16]，而質(zhì)膜中的質(zhì)子泵（F1F0-ATPase）可以將胞內(nèi)質(zhì)子泵出胞外來提高胞內(nèi)的pH，從而形成跨膜pH梯度差[17]，并產(chǎn)生運(yùn)輸系統(tǒng)需要的質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)，使代謝酶的活力不受影響，H+-ATPase的這種pH調(diào)控作用增強(qiáng)了細(xì)胞耐酸性，采用H+-ATPase缺陷型的保加利亞乳桿菌作為發(fā)酵菌株降低酸乳貯存期的后酸化程度已得到證實(shí)[5]，本實(shí)驗(yàn)測定了四株菌的H+-ATPase酶活如表1所示。

表1 菌株H+-ATPase活力的變化Table 1 The H+-ATPase activity of the strains

本實(shí)驗(yàn)中24h菌株的H+-ATPase酶活差異顯著，其中后酸化強(qiáng)的KLDS1.0207酶活最高，達(dá)到2.6U/mg，而后酸化弱的其他三株菌株KLDS1.1006、1.1011和1.1015的酶活分別為1.76、1.39、1.56U/mg，可見，菌株的H+-ATPase酶活高低與其后酸化強(qiáng)弱之間確實(shí)存在緊密的相關(guān)性，這主要是由于H+-ATPase酶活低時(shí)，菌株代謝能力弱，不能水解足夠的ATP維持菌株高強(qiáng)度的新陳代謝，所以菌株的耐酸性及產(chǎn)酸速度都較弱，從而一定程度上減緩了后酸化?？梢姡琀+-ATPase是保加利亞乳桿菌產(chǎn)酸關(guān)鍵酶，其酶活差異可以很大程度上影響菌株的后酸化水平，且H+-ATPase較弱是造成菌株KLDS1.1006和KLDS1.1011弱后酸化的主要原因之一。Ongol等[5]和劉飛等[6]學(xué)者指出篩選出低H+-ATPase活性的菌株，可降低其耐酸性，使其生長受到抑制，從而有效減少酸乳的后酸化，本實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果與其完全相符。

2.2 低溫貯存過程中pH及滴定酸度的變化

Donkor在4℃貯藏條件下對(duì)酸奶后酸化進(jìn)行研究[18]，認(rèn)為高質(zhì)量的酸奶在消費(fèi)者消費(fèi)時(shí)，其pH應(yīng)為4.2～4.3，酸奶制品的酸度應(yīng)為70.0～110.0°T之間。本實(shí)驗(yàn)選取4℃為貯存溫度，發(fā)酵乳均在pH為6.3～6.4左右轉(zhuǎn)入4℃后熟，分別測試在4℃貯藏第1d至第13d的pH和滴定酸度的變化。由圖4可知四株德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵的酸奶制品在貯存2～4d即發(fā)生后酸化，幾株菌后酸化情況相差很大，其中菌株KLDS1.1006和KLDS1.1011在貯存13d后，后酸化程度較弱。

圖3 貯存期間四菌株pH變化曲線Fig.3 pH curve of the four strains in the storage duration

圖4 貯存期間四株菌的滴定酸度變化曲線Fig.4 Acidity curve of the four strains in the storage duration

由圖3和圖4可知，菌株KLDS1.1011和KLDS1.1006的后酸化情況與商業(yè)弱后酸化菌株KLDS1.1015不相上下，在貯存13d后，pH仍能維持在4.4～4.5之間，滴定酸度在80～88°T之間，增長量不足10°T；在前4d里，酸度升高pH下降趨勢(shì)明顯，而貯存后期變化很平緩，產(chǎn)酸很弱，低溫貯存實(shí)驗(yàn)再次驗(yàn)證了菌株KLDS1.1011和KLDS1.1006為弱后酸化菌株。

2.3 β-半乳糖苷酶活性的測定

2.3.1 ONP標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定 以O(shè)NP濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)為0.9992，線性良好，結(jié)果如圖5所示。

圖5 ONP標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 ONP standard curve

2.3.2 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定 以牛血清白蛋白（BSA）為橫坐標(biāo)，吸光度（OD值）為縱坐標(biāo)繪標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)為0.9915，結(jié)果如圖6所示。

圖6 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Protein standard curve

2.3.3 酸奶貯存期間β-半乳糖苷酶活力的變化 后酸化強(qiáng)弱程度不同的菌株在代謝乳糖這一步上差異很大，乳糖到葡萄糖到乳酸是產(chǎn)酸的關(guān)鍵途徑，后酸化程度強(qiáng)的菌株乳糖代謝多，后酸化程度弱的菌株情況相反，所以分解乳糖的β-半乳糖苷酶作用重大[19]。迄今為止已經(jīng)有很多通過改變保加利亞乳桿菌β-半乳糖苷酶的活性來控制發(fā)酵酸乳后酸化的研究，如令編碼β-半乳糖苷酶的基因缺失或是將編碼β-半乳糖苷酶的基因進(jìn)行無意義的突變，或是擾亂乳糖操作子編碼序列，從而改變野生菌株中β-半乳糖苷酶活性，從而一定程度上減緩后酸化水平，可見改變菌株的β-半乳糖苷酶活性可有效降低酸奶后酸化水平[20]。

由于菌株在0～2d貯存期內(nèi)pH下降極快，第4d是真正決定后酸化強(qiáng)弱的關(guān)鍵一天[7]，故本實(shí)驗(yàn)分別測試在4℃貯藏第1、4、10、13d的β-半乳糖苷酶酶活。結(jié)果如表2所示。

由表2可以看出，后酸化不同的菌株的β-半乳糖苷酶活力還是存在較大區(qū)別的，并且在貯存期間，β-半乳糖苷酶提供較大活力來代謝糖產(chǎn)酸，其中后酸化強(qiáng)的菌株KLDS-1.0207活力高，后酸化弱的菌株KLDS1.1006、KLDS1.015和KLDS1.1011活力低，對(duì)于前4d菌株產(chǎn)酸的關(guān)鍵時(shí)期，不同菌株的β-半乳糖苷酶均表現(xiàn)出很高的酶活，說明這時(shí)為乳糖代謝產(chǎn)酸的高峰期，也是β-半乳糖苷酶酶活的高峰期，對(duì)于乳糖產(chǎn)酸的貢獻(xiàn)很大，這與其他學(xué)者在關(guān)于β-半乳糖苷酶在后酸化產(chǎn)酸過程中為關(guān)鍵酶的報(bào)道一致[10]。隨著貯存時(shí)間的延長，菌體的物質(zhì)和能量代謝受到影響，乳酸產(chǎn)量增多，反過來抑制了β-半乳糖苷酶的活性，使其活性逐漸下降，在貯存10～13d后，β-半乳糖苷酶酶活已降到很低，但由于環(huán)境介質(zhì)的pH未降到3.5，所以β-半乳糖苷酶活性仍有剩余，仍能緩慢的代謝糖產(chǎn)酸，導(dǎo)致酸度繼續(xù)增加，β-半乳糖苷酶活活性的變化與貯存期間產(chǎn)酸的趨勢(shì)完全一致，可見β-半乳糖苷酶是菌株貯存期間的關(guān)鍵酶，這也進(jìn)一步說明菌株KLDS1.1006和KLDS1.1011后酸化較弱的一個(gè)重要原因是貯存期間β-半乳糖苷酶活力較弱導(dǎo)致的。

表2 貯存期間β-半乳糖苷酶活力的變化Table 2 The β-galactosidase activity of the strains during storage

有研究表明，β-半乳糖苷酶與H+-ATPase活性一致并且互相影響[6]。在糖酵解過程中，如果β-半乳糖苷酶活性較高，乳糖分解加快，葡萄糖分解為丙酮酸產(chǎn)生ATP的速度也加快，這正給了H+-ATPase提供了能量，從而增加了菌株細(xì)胞的代謝活性，向胞外排出更多質(zhì)子，加重了后酸化。所以本實(shí)驗(yàn)中得到后酸化較弱的菌株KLDS1.1006和KLDS1.1011的H+-ATPase和β-半乳糖苷酶都較弱是合理的。

2.4 乳酸脫氫酶活性的測定

幾乎所有的保加利亞乳桿菌都存在乳酸脫氫酶，葡萄糖經(jīng)糖酵解生成的丙酮酸，在乳酸脫氫酶的作用下被分解為乳酸，因此，乳酸脫氫酶被認(rèn)為是糖酵解中關(guān)鍵酶和限速酶，其中保加利亞乳桿菌中存在依賴于NADH的D-乳酸脫氫酶和L-乳酸脫氫酶，它們以NADH為輔酶，分別催化丙酮酸生成D-乳酸和L-乳酸。酸乳發(fā)酵過程，嗜熱鏈球菌主要產(chǎn)L-乳酸，而保加利亞乳桿菌主要產(chǎn)D-乳酸。其中D-乳酸是導(dǎo)致酸乳后酸化的主要因素[21]。

本實(shí)驗(yàn)中一個(gè)酶活力單位定義為25℃時(shí)，每分鐘氧化1μmol的NADH所需的酶量。通過對(duì)A和時(shí)間作圖，計(jì)算出△A340nm/min均在0.1～0.2之間，符合要求。貯存期間菌株的乳酸脫氫酶活力變化如表3。

由表3可知，隨著貯存時(shí)間的延長，不同菌株的乳酸脫氫酶的活力變化均不明顯，前10d菌株KLDS1.1011和KLDS1.1006的酶活有小幅度的下降趨勢(shì)，10～13d期間有一定程度的上升，但變化并不是很明顯，而菌株KLDS1.0207在前10d內(nèi)酶活小幅度上升，后期有所下降，且對(duì)于產(chǎn)酸最快的前4d來說，LDH并沒有提供足夠高的酶活以保證高乳酸含量的產(chǎn)生，貯存末期低溫和酸度也沒有明顯的限制LDH的活力，總體來說，后酸化強(qiáng)弱不同的菌株之間酶活沒有明顯的相關(guān)性，在貯存期間糖酵解產(chǎn)酸通量即后發(fā)酵產(chǎn)酸過程與乳酸脫氫酶活性變化之間沒有一致性。李琦[7]測試了嗜熱鏈球菌單菌發(fā)酵乳在低pH貯存過程中乳酸脫氫酶的活性，結(jié)果也顯示乳酸脫氫酶并不是導(dǎo)致后酸化的關(guān)鍵酶。

表3 貯存期間乳酸脫氫酶活力的變化Table 3 The lactate dehydrogenase activity of the strains during storage

2.5 蛋白酶活性的測定

菌株的蛋白水解力與生長性能有直接關(guān)系，蛋白水解力體現(xiàn)了乳酸菌的活力大小，菌株通過蛋白水解為自身代謝提供氨基酸和肽類，且一部分是酸奶中的風(fēng)味物質(zhì)或其前體[22]，適度的蛋白水解可改善發(fā)酵乳的風(fēng)味和品質(zhì)，且產(chǎn)生的堿性氨基酸一定程度上可降低后酸化。本實(shí)驗(yàn)用蛋白水解力代表蛋白酶活力，菌株貯存期間蛋白水解活力如圖7所示。

由圖7可以看出，不同乳桿菌的蛋白酶活力差異較大，蛋白酶活隨冷藏天數(shù)的增加總體呈上升趨勢(shì)，呈現(xiàn)出一定的規(guī)律性，貯存末期達(dá)到最大值；其中后酸化最強(qiáng)的菌株KLDS1.0207蛋白水解力較弱，而后酸化較弱的菌株KLDS1.1006和KLDS1.1011蛋白水解力最強(qiáng)，商業(yè)發(fā)酵劑弱后酸菌株KLDS1.1015蛋白水解力最弱，這說明菌株蛋白酶活力與后酸化強(qiáng)弱之間并沒有必然聯(lián)系，因?yàn)榈鞍姿馐芫陚€(gè)體差異的影響較大，往往正是因?yàn)榫晟飳W(xué)特性的差異而影響到其蛋白分解能力[23]。

圖7 貯存期間蛋白酶活力的變化Fig.7 The The Proteinase activity of the strains during storage

3 結(jié)論

3.1 菌株KLDS1.1006和KLDS1.1011后酸化較弱的重要原因就是其H+-ATPase和β-半乳糖苷酶同時(shí)較弱，其中H+-ATPase較弱使能量代謝受到影響，降低了菌株的耐酸性和產(chǎn)酸速率；β-半乳糖苷酶較弱可以使貯存期乳糖的代謝速率變慢，從而延長了酸奶的后酸化時(shí)間，有效的降低后酸化程度，可見菌株KLDS1.1006和KLDS1.1011可用作降低酸乳后酸化的天然發(fā)酵劑菌株，其性狀穩(wěn)定，操作簡單，擁有廣闊的市場前景。

3.2 菌株KLDS1.1006和KLDS1.1011的乳酸脫氫酶和蛋白酶與其弱后酸化之間沒有表現(xiàn)出必然聯(lián)系，可以認(rèn)為這兩種酶不是影響產(chǎn)酸和后酸化的關(guān)鍵酶，更不是導(dǎo)致菌株KLDS1.1006和KLDS1.1011弱后酸化的關(guān)鍵酶。

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