抑制牛乳房炎嗜酸乳桿菌的篩選和抑菌物質(zhì)的研究

肖 蒙，孟昭旭，楊曉春，杜 鵬，霍貴成

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150030）

乳房炎主要是指一種由致病菌通過乳房導(dǎo)管進(jìn)入乳房?jī)?nèi)不斷繁殖而導(dǎo)致的炎癥[1-2]。當(dāng)奶牛分泌的牛奶中體細(xì)胞數(shù)超過200，000個(gè)/mL時(shí)，就可以診斷此?；加腥榉垦譡3]。據(jù)世界奶牛協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)，全世界約有2.2億頭奶牛，乳房炎的發(fā)病率在50%左右，其中牛臨床型乳房炎患病率為2%，隱性乳房炎高達(dá)50%[4-5]，每年由乳房炎造成的直接經(jīng)濟(jì)損失約為350億美元[6]。奶牛發(fā)生乳房炎不僅可造成產(chǎn)奶量下降10%～15%[7]、乳汁pH升高、奶中營(yíng)養(yǎng)成分顯著降低，而且還嚴(yán)重影響奶及奶制品的食品安全，因?yàn)槟膛；既榉垦缀笏a(chǎn)的乳汁中含有大量的炎癥因子、致病菌和毒素[8]。致病菌是導(dǎo)致乳房炎的主要因素，國內(nèi)外很多學(xué)者就導(dǎo)致牛乳房炎的致病菌種類進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：引起乳房炎的病原微生物多達(dá)150多種，但最常見的約有20多種，其中主要以無乳鏈球菌為主，其次是停乳鏈球菌、乳房鏈球菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等[9]?，F(xiàn)在治療乳房炎一般均采用抗菌藥特別是抗生素乳房?jī)?nèi)灌注方法，抗生素不僅能引起病原微生物產(chǎn)生耐藥性[10]，使通過抗生素治療乳房炎的難度越來越大，更重要的是造成了抗生素在牛奶中大量殘留，從而引起食用者產(chǎn)生過敏反應(yīng)、皮疹、哮喘、休克甚至死亡[11]。近年來，國外有很多學(xué)者對(duì)乳酸菌治療乳房炎進(jìn)行了研究，乳酸菌是益生菌的重要組成部分，它不僅能在人體腸道等重要部位發(fā)揮益生功能[12-13]，而且不會(huì)讓致病菌產(chǎn)生耐藥性，安全性高，這主要是因?yàn)槿樗峋a(chǎn)生的H2O2[14]，有機(jī)酸，如乙酸、丙酸、乳酸等[15]和抗生素或細(xì)菌素類物質(zhì)具有較強(qiáng)的殺菌作用[16-18]。所以本文以乳酸菌的抑菌作用為理論基礎(chǔ)，研究6株嗜酸乳桿菌及其代謝產(chǎn)物中的抑菌成分：細(xì)菌素、H2O2、有機(jī)酸分別對(duì)導(dǎo)致牛乳房炎的4株主要致病菌：無乳鏈球菌、乳房鏈球菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果，從而得出6株乳酸菌的各種代謝產(chǎn)物對(duì)各致病菌的抑菌活力，以及各乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素和H2O2在何種環(huán)境下才能更好的發(fā)揮抑菌作用，為將來用乳酸菌的抑菌代謝產(chǎn)物治療牛乳房炎，乃至適當(dāng)取代抗生素和治療更多由致病菌引起的疾病奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種 嗜酸乳桿菌KLDS L2、KLDS L6、KLDS AD1、KLDS AD2、KLDS AD3和NCFM；無乳鏈球菌ATCC 13813、乳房鏈球菌、大腸桿菌ATCC 25922、金黃色葡萄球菌ATCC 25923 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室乳品工業(yè)微生物菌種保藏中心（KLDSDICC）；THB培養(yǎng)基 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司，牛肉粉10g/L、胰蛋白胨20g/L、葡萄糖2g/L、碳酸氫鈉2g/L、氯化鈉2g/L、磷酸氫二鉀0.4g/L；MRS肉湯培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，酪蛋白酶消化物10g/L、牛肉膏粉10g/L、酵母膏粉4g/L、檸檬酸三銨2g/L、乙酸鈉5g/L、硫酸鎂0.2g/L、硫酸錳0.05g/L、磷酸氫二鉀2g/L、葡萄糖20g/L、吐溫-80 1.08g/L；LB培養(yǎng)基 胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L；固體培養(yǎng)基 添加2%瓊脂；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技有限公司。

UV-2401PC紫外分光光度計(jì) 日本島津。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 16S rDNA菌種的鑒定和致病菌的生長(zhǎng)曲線的制備 對(duì)無乳鏈球菌ATCC 13813（編號(hào)M1，下同）、乳房鏈球菌（M2）、大腸桿菌ATCC 25922（M3）、金黃色葡萄球菌ATCC 25923（M4）4株菌種進(jìn)行16SrDNA鑒定，防止菌種出現(xiàn)誤差。

將M1、M2分別接種在THB液體培養(yǎng)基中，37℃條件下培養(yǎng)，每隔1h取樣，將M3、M4分別接種在LB液體培養(yǎng)基中，37℃條件下培養(yǎng)，每隔3h取樣，都在600nm下測(cè)OD值，然后以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)做出各個(gè)致病菌的生長(zhǎng)曲線圖。最后根據(jù)生長(zhǎng)曲線，取穩(wěn)定期的菌株進(jìn)行稀釋平板計(jì)數(shù)。

1.2.2 乳酸菌酸度曲線的描繪 將6株乳酸菌按照2%接種量分別接種在MRS液體培養(yǎng)基中，每4h取樣滴定酸度，測(cè)發(fā)酵液的pH，最后以時(shí)間為橫坐標(biāo)，pH為縱坐標(biāo)描繪乳酸菌的酸度曲線圖。

1.2.3 乳酸菌無細(xì)胞上清液的制備和各上清液抑菌能力的研究 將6株嗜酸乳桿菌KLDS L2、KLDS L6、KLDS AD1、KLDS AD2、KLDS AD3和NCFM分別編號(hào)為H2、H3、H4、H5、H6、H7，分別接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48h，10000g，4℃條件下離心20min，再用0.22μm的濾膜過濾得到乳酸菌無細(xì)胞上清液[19]。

將500μL的105CFU/mL致病菌的稀釋液涂布在各自最適固體培養(yǎng)基上，水平放置在4℃冰箱中12h，使培養(yǎng)基完全吸收掉稀釋液，然后進(jìn)行牛津杯抑菌實(shí)驗(yàn)，在牛津杯中注入200μL的乳酸菌無細(xì)胞發(fā)酵上清液，每組3個(gè)平行，最后將其放在37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)8h，觀察此牛津杯瓊脂擴(kuò)散抑菌實(shí)驗(yàn)是否產(chǎn)生抑菌圈[20]，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈的直徑（減去牛津杯直徑），得到數(shù)據(jù)，做出柱狀圖，由此判斷各乳酸菌對(duì)各致病菌的抑菌性強(qiáng)弱。

1.2.4 溫度對(duì)乳酸菌無細(xì)胞上清液的影響 將乳酸菌無細(xì)胞上清液在80℃條件下水浴15min，然后用牛津杯法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)（方法同1.2.3）。并將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與1.2.3各菌株原上清液的抑菌數(shù)據(jù)比較，做出柱狀圖，確定溫度對(duì)上清液中抑菌活性物質(zhì)的影響。

1.2.5 H2O2酶對(duì)乳酸菌無細(xì)胞上清液抑菌性的影響向上清液中加入H2O2酶，使其終濃度達(dá)到1mg/mL，在37℃條件下溫浴2h，用此上清液做抑菌實(shí)驗(yàn)（方法同1.2.3），并將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與1.2.3各菌株原上清液的抑菌數(shù)據(jù)比較，做出柱狀圖，確定上清液中H2O2的抑菌效果。

1.2.6 胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K對(duì)乳酸菌無細(xì)胞上清液的影響 在乳酸菌無細(xì)胞上清液中依次加入胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K干粉，使各蛋白酶的終濃度達(dá)到1mg/mL，然后在37℃條件下溫浴2h，做抑菌實(shí)驗(yàn)（方法同1.2.3），并將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與1.2.3各菌株原上清液的抑菌數(shù)據(jù)比較，確定上清液中細(xì)菌素類物質(zhì)的抑菌效果。

1.2.7 不同pH條件對(duì)乳酸菌無細(xì)胞上清液中抑菌活性物質(zhì)的影響 用高濃度的乳酸和NaOH溶液將各上清液的pH調(diào)節(jié)為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，最后用牛津法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)（方法同1.2.3），確定不同pH對(duì)上清液中抑菌活性物質(zhì)的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 16S rDNA菌種鑒定結(jié)果和致病菌生長(zhǎng)曲線

圖1 4株致病菌生長(zhǎng)曲線Fig.1 The growth curve of 4 strains of pathogenic bacteria

16S rDNA菌種鑒定結(jié)果表明，各菌株為編號(hào)所對(duì)應(yīng)的菌株，菌種無差錯(cuò)。如圖1所示為M1、M2、M3、M4這4株致病菌的生長(zhǎng)曲線圖，可見，M1、M2開始生長(zhǎng)迅速，但由于培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，代謝產(chǎn)物的積累等負(fù)面因素的影響，最終在5h左右時(shí)達(dá)到最大OD值1.50左右，到達(dá)穩(wěn)定期，同理，M3、M4在18h左右達(dá)到最大OD值1.10左右，到達(dá)穩(wěn)定期，所以分別在此時(shí)間點(diǎn)取樣進(jìn)行稀釋涂布計(jì)數(shù)，結(jié)果表明，M1、M2能達(dá)到3.0×108CFU/mL，M3、M4達(dá)到2.1×107CFU/mL。

2.2 乳酸菌酸度曲線描繪

圖2 6株乳酸菌的酸度曲線圖Fig.2 The acidity curve of 6 strains of lactic acid bacteria

6株嗜酸乳桿菌的酸度曲線圖如圖2所示，可見6株菌基本隨著發(fā)酵的不斷進(jìn)行，培養(yǎng)基中的糖被乳酸菌分解成為有機(jī)酸，從而使pH不斷降低，基本都在24h后達(dá)到最低pH，但H6、H4、H7最終pH較低，其中H7最低，達(dá)到了3.50。

2.3 各乳酸菌上清液抑菌能力

如圖3（a）所示，各乳酸菌上清液對(duì)M1抑菌活性大?。篐7＞H3＞H6＞H4＞H5＞H2；同理，圖3（b）表明，在抑制M2方面，抑菌活性大?。篐7＞H4＞H6＞H3＞H2＞H5；圖3（c）表明，在抑制M3方面，抑菌活性大小：H7＞H3＞H6＞H5＞H4＞H2；圖3（d）表明，在抑制M4方面，抑菌活性大小：H7＞H2＞H6＞H5＞H4＞H3。影響上清液抑菌活性的物質(zhì)主要是有機(jī)酸、細(xì)菌素和H2O2，所以以上上清液的抑菌活性是三種抑菌物質(zhì)共同作用的結(jié)果，綜合而言，H7對(duì)4株致病菌的抑菌效果最好，抑菌圈直徑都達(dá)到a、b、c、d的最大值，特別是對(duì)M3和M4效果最顯著，數(shù)值分別達(dá)到14.13mm和12.76mm，H6對(duì)4株致病菌的抑制效果良好，結(jié)合實(shí)驗(yàn)1.2.2，這可能與H7、H6較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力有關(guān)，同時(shí)，6株乳酸菌普遍都對(duì)M4的抑制效果顯著，抑菌圈直徑都基本超過9.00mm。

圖3 6株乳酸菌上清液對(duì)4株致病菌抑菌效果Fig.3 The inhibitory effect of 6 strains of lactic acid bacteria supernatant fluid on 4 strains of pathogenic bacteria

2.4 溫度對(duì)乳酸菌上清液抑菌能力影響

經(jīng)高溫處理之后的上清液對(duì)各致病菌的抑菌效果如圖4中的h2～h7（編號(hào)為：H2～H7的嗜酸乳桿菌經(jīng)處理后在圖中標(biāo)示為：h2～h7以方便區(qū)分，圖4～圖6同）所示，將這些柱狀圖與圖3進(jìn)行對(duì)比，得到圖4。

圖4（a）表明，高溫處理對(duì)各乳酸菌上清液抑菌活性（M1）影響大?。篐5＞H6＞H4＞H3＞H7＞H2；同理，圖4（b）表明，高溫處理對(duì)各乳酸菌上清液抑菌活性（M2）影響大小：H4＞H2＞H5＞H7＞H3＞H6；圖4（c）表明高溫處理對(duì)各乳酸菌上清液抑菌活性（M3）影響大?。篐5＞H7＞H4＞H2＞H3=H6；圖4（d）表明，高溫處理對(duì)各乳酸菌上清液抑菌活性（M4）影響大小：H5＞H4＞H6＞H3＞H2＞H7。綜上所述，高溫對(duì)H5上清液的抑菌活性影響最大，處理后的H5的抑菌圈直徑縮小值在a、c、d中都達(dá)到最大，在b中也達(dá)到0.50mm，但處理后的H3在a、b、c中對(duì)各致病菌抑菌圈直徑影響較小，分別為0.19、0.20、0.26mm，這可能主要是由于H5、H3抑菌活性產(chǎn)物分別熱敏性較高和耐熱力較強(qiáng)的緣故。

圖4 高溫處理的6株乳酸菌上清液對(duì)4株致病菌的影響Fig.4 The effect of 6 strains of lactic acid bacteria supernatant fluid processed by high-temperature on 4 strains of pathogenic bacteria

2.5 H2O2酶對(duì)乳酸菌上清液抑菌性影響

經(jīng)H2O2酶處理之后的上清液對(duì)各致病菌的抑菌效果如圖5中的h2～h7所示，將這些柱狀圖與圖3進(jìn)行對(duì)比，得到圖5。

圖5 H2O2酶處理的6株乳酸菌上清液對(duì)4株致病菌的影響Fig.5 The effect of 6 strains of lactic acid bacteria supernatant fluid processed by H2O2enzyme on 4 strains of pathogenic bacteria

如圖5（a）所示，H2O2酶處理對(duì)各乳酸菌上清液抑菌活性（M1）影響大?。篐4＞H6＞H5＞H3＞H2＞H7；同理，圖5（b）表明，H2O2酶處理對(duì)各乳酸菌上清液抑菌活性（M2）影響大?。篐7＞H3＞H4＞H5＞H6＞H2；圖5（c）表明，H2O2酶處理對(duì)各乳酸菌上清液抑菌活性（M3）影響大小：H3＞H7＞H5＞H6＞H4＞H2；圖5（d）表明，H2O2酶處理對(duì)各乳酸菌上清液抑菌活性（M4）影響大小：H6＞H3＞H2＞H4＞H7＞H5。由圖5可見，6株乳酸菌經(jīng)過H2O2酶處理之后，抑菌活性都降低了，這是由于乳酸菌產(chǎn)生的具有抑菌作用的代謝產(chǎn)物H2O2被H2O2酶分解的緣故，可以通過此方法鑒定各乳酸菌產(chǎn)H2O2能力，以及H2O2對(duì)不同致病菌的殺菌能力，上述結(jié)果表明：處理后的H3對(duì)M2、M3、M4抑菌圈直徑分別降低了2.20、6.47、1.46mm，在b、c、d中抑菌活性降低程度很大，但其他乳酸菌產(chǎn)生的H2O2對(duì)4株致病菌的抑菌活力差異性較大，這可能是由于不同乳酸菌產(chǎn)生的H2O2量不同，同時(shí)H2O2對(duì)不同致病菌具有不同抑制性的緣故。

2.6 胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K對(duì)乳酸菌上清液影響

經(jīng)各種蛋白酶處理之后的上清液對(duì)各致病菌的抑菌效果如圖6中的h2～h7所示，將這些柱狀圖與圖3進(jìn)行對(duì)比，得到圖6。

如圖6（a）表明，蛋白酶處理對(duì)各乳酸菌上清液抑菌活性（M1）影響大小：H6＞H4＞H2＞H3＞H5＞H7；同理，圖6（b）表明，蛋白酶處理對(duì)各乳酸菌上清液抑菌活性（M2）影響大小：H3＞H5＞H4＞H7＞H6＞H2；圖6（c）表明，蛋白酶處理對(duì)各乳酸菌上清液抑菌活性（M3）影響大?。篐3＞H7＞H5＞H6＞H2＞H4；圖6（d）表明，蛋白酶處理對(duì)各乳酸菌上清液抑菌活性（M4）影響大?。篐5＞H6＞H2＞H7＞H3＞H4。經(jīng)過各種蛋白酶處理的上清液的抑菌活性都明顯降低，這是由于乳酸菌產(chǎn)生的蛋白質(zhì)類細(xì)菌素代謝產(chǎn)物被蛋白酶分解的緣故，所以，可以通過此方法鑒定乳酸菌產(chǎn)細(xì)菌素量。綜合而言，處理后的H3對(duì)M2、M3的抑菌圈直徑縮小值分別為1.62、3.47mm，在b、c中都為最大值；處理后的H5對(duì)M2、M4的抑菌圈直徑縮小值分別為1.33、1.58mm，在b、d中抑菌活性降低程度很大，圖6也充分說明同一株乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素對(duì)不同的致病菌抑菌性有明顯的差異，可見在利用細(xì)菌素治療乳房炎之前對(duì)其致病菌進(jìn)行鑒定，然后進(jìn)行有針對(duì)性的治療。

圖6 蛋白酶處理的6株乳酸菌上清液對(duì)4株致病菌的影響Fig.6 The effect of 6 strains of lactic acid bacteria supernatant fluid processed by protease on 4 strains of pathogenic bacteria

2.7 不同pH條件對(duì)乳酸菌上清液中抑菌活性物質(zhì)的影響

H2～H7的上清液經(jīng)在不同pH條件下對(duì)4種致病菌的抑菌效果圖7～圖10所示：隨著pH不斷降低，上清液的抑菌能力不斷增強(qiáng)，特別是當(dāng)pH≤3.5左右時(shí)，隨著pH降低，各乳酸菌上清液抑菌能力增幅較大，可見pH對(duì)上清液的抑菌能力影響很大；但當(dāng)pH≥5時(shí)，H2和H4的上清液對(duì)部分致病菌已無抑菌性。同時(shí)只有H3、H5、H6、H7在pH=6.0、7.0時(shí)，還具有一定的抑菌能力，這說明各菌產(chǎn)生的細(xì)菌素和H2O2在酸性環(huán)境下才能更好的發(fā)揮抑菌作用。

圖7 不同pH條件下6株乳酸菌上清液對(duì)M1抑制效果Fig.7 The inhibitory effect of 6 strains of lactic acid bacteria supernatant fluid on M1 in different pH conditions

圖8 不同pH條件下6株乳酸菌上清液對(duì)M2抑制效果Fig.8 The inhibitory effect of 6 strains of lactic acid bacteria supernatant fluid on M2 in different pH conditions

圖9 不同pH條件下6株乳酸菌上清液對(duì)M3抑制效果Fig.9 The inhibitory effect of 6 strains of lactic acid bacteria supernatant fluid on M3 in different pH conditions

圖10 不同pH條件下6株乳酸菌上清液對(duì)M4抑制效果Fig.10 The inhibitory effect of 6 strains of lactic acid bacteria supernatant fluid on M4 in different pH conditions

3 結(jié)論

3.1 由于造成乳房炎的致病菌以及不同乳酸菌分泌的抑菌物質(zhì)對(duì)同一株致病菌抑制作用都存在差異，所以以各株致病菌為標(biāo)準(zhǔn)，分析不同上清液對(duì)同一株致病菌的影響。結(jié)果表明，6株嗜酸乳桿菌都能對(duì)4株導(dǎo)致牛乳房炎的致病菌特別是金黃色葡萄球菌起到明顯的抑制效果，其中NCFM（H7）對(duì)4株致病菌抑制效果最好，KLDS AD3（H6）良好，又由于這兩株菌產(chǎn)生的細(xì)菌素和H2O2抑菌活力一般，結(jié)合酸度曲線圖，所以這與二者具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力有重要關(guān)系。

3.2 KLDS AD3（H6）細(xì)菌素對(duì)M1無乳鏈球菌抑菌效果最好；KLDS AD2（H5）細(xì)菌素對(duì)M4金黃色葡萄球菌抑制效果最好，同時(shí)，KLDS AD2（H5）的抑菌代謝產(chǎn)物熱敏性最高；KLDS L6（H3）細(xì)菌素類物質(zhì)對(duì)M2乳房鏈球菌、M3大腸桿菌抑菌效果最好，且其抑菌活性物質(zhì)耐熱能力較強(qiáng)，保持適當(dāng)?shù)乃嵝原h(huán)境有利于提高抑菌活性物質(zhì)的抑菌能力。

3.3 由于不同地區(qū)，不同環(huán)境，造成牛乳房炎的致病菌種類存在差異性，所以治療之前鑒定出主要的致病菌，然后篩選出對(duì)特定致病菌抑制效果較好的乳酸菌上清液或單一的抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行治療，將會(huì)使治療更加具有針對(duì)性，從而達(dá)到更好的治療效果。

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