固態(tài)發(fā)酵食醋有機(jī)酸組成分析中樣品預(yù)處理方法的研究

余永建，鄧曉陽，陸震鳴，史勁松，許正宏，3，*

（1.江南大學(xué)藥學(xué)院制藥工程研究室，江蘇無錫 214122；2.江南大學(xué)藥學(xué)院生物活性制品加工工程研究室，江蘇無錫214122；3.國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川瀘州 646000）

傳統(tǒng)固態(tài)釀造食醋具有悠久的歷史，是深受我國人民喜愛的一種調(diào)味品[1]。發(fā)酵食醋中有機(jī)酸種類豐富，除乙酸外尚存在乳酸、蘋果酸、檸檬酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、富馬酸等多種不揮發(fā)酸，對(duì)食醋的口感具有重要影響[2]。例如，琥珀酸可增強(qiáng)醋的鮮味，乳酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸等可以緩沖乙酸的刺激性，使醋液酸味柔和、醇厚。食醋中有機(jī)酸主要來源于固態(tài)釀造過程中各種微生物的代謝活動(dòng)，且不同釀造原料和工藝生產(chǎn)的食醋中有機(jī)酸組成差別較大。準(zhǔn)確測(cè)定食醋中有機(jī)酸的種類和含量，對(duì)于評(píng)價(jià)食醋品質(zhì)及解析食醋釀造機(jī)理具有重要意義。已有學(xué)者采用包括高效液相色譜法（HPLC）、離子排斥色譜法、氣相色譜法在內(nèi)的多種現(xiàn)代儀器分析方法測(cè)定了發(fā)酵食醋有機(jī)酸的組成[3-5]，其中HPLC具有高效快速、靈敏度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，使用最為普遍。另一方面，食醋中除了富含有機(jī)酸以外，還含有大量蛋白質(zhì)、多糖、果膠等生物大分子物質(zhì)，以及色素、鞣質(zhì)、無機(jī)鹽等小分子物質(zhì)。這些物質(zhì)的存在容易導(dǎo)致食醋有機(jī)酸HPLC分析過程中柱壓升高、使用壽命降低、有機(jī)酸分離度下降等問題，因此樣品一般需要經(jīng)過前處理，以去除干擾物質(zhì)。本論文對(duì)食醋有機(jī)酸分析過程中的樣品預(yù)處理方法進(jìn)行研究，比較了4種大分子雜質(zhì)沉淀方法，以及4種小分子雜質(zhì)去除方法對(duì)食醋樣品預(yù)處理及有機(jī)酸定量分析結(jié)果的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

固態(tài)發(fā)酵食醋樣品 從市場(chǎng)購得，總酸含量分別為4.5、5.0、5.5、6.0g/100mL；磷酸、磷酸二氫鈉、亞鐵氰化鉀、硫酸鋅、乙酸 均為分析純，中國醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司；甲醇 色譜純，中國醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司；草酸、丙酮酸、檸檬酸、乳酸、酒石酸、琥珀酸、富馬酸、蘋果酸 均為色譜純，Sigma-Aldrich（上海）公司；有機(jī)酸標(biāo)樣溶液（mg/mL）

草酸0.50，酒石酸2.01，丙酮酸1.10，α-酮戊二酸0.22，乳酸25.02，乙酸49.99，檸檬酸2.00，焦谷氨酸2.01，琥珀酸4.00。

pH計(jì)、電子天平 Mettler Toledo儀器（上海）有限公司；高效液相色譜 DIONEX公司；固相萃取小柱 Sep-Pak C18，Supelclean LC-SAX，Supelclean LCNH2，美國Waters公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 沉淀劑的選擇 分別取5mL不同總酸含量（4.5、5.0、5.5、6.0g/100mL）的醋樣，加入5mL已知濃度的有機(jī)酸標(biāo)樣，然后按照下述4種方法分別進(jìn)行蛋白沉淀。

1.2.1.1 亞鐵氰化鉀-硫酸鋅沉淀法 加入2mL 10.6%亞鐵氰化鉀（10.6g用水定容至100mL）和2mL 30%硫酸鋅（30g用水定容至100mL）溶液，搖勻后用超純水定容至100mL，靜置0.5h后用雙層濾紙過濾，取濾液。

1.2.1.2 亞鐵氰化鉀-乙酸鋅沉淀法 加入2mL 10.6%亞鐵氰化鉀和2mL的21.9%乙酸鋅（21.9g加冰乙酸3mL，加水定容至100mL）溶液，搖勻后用超純水定容至100mL，靜置0.5h后用雙層濾紙過濾，取濾液。

1.2.1.3 乙醇沉淀法 緩慢加入30mL無水乙醇，10000r/min離心10min后取上清液。

1.2.1.4 三氯乙酸沉淀法 緩慢加入10mL三氯乙酸（10%），10000r/min離心10min后取上清液。

分別取經(jīng)上述沉淀處理后的樣品用0.22μm微孔濾膜過濾，濾液再用Sep-Pak C18固相萃取小柱進(jìn)行處理后進(jìn)行HPLC分析，測(cè)定有機(jī)酸的加標(biāo)回收率。

1.2.2 小分子雜質(zhì)去除方法的比較 取4種不同總酸含量（4.5、5.0、5.5、6.0g/100mL）的醋樣5mL，加入5mL已知濃度的標(biāo)樣，用1.2.1中確定的蛋白沉淀方法進(jìn)行處理，上清液用0.22μm微孔濾膜過濾，濾液采用固相萃取小柱或活性炭進(jìn)行處理，具體方法如下。

1.2.2.1 Sep-Pak C18固相萃取小柱 小柱用5mL甲醇進(jìn)行活化，然后用5mL超純水平衡；將樣品溶液緩慢流過小柱，流速1mL/min。

1.2.2.2 Supelclean LC-SAX固相萃取小柱 小柱用5mL甲醇活化，然后用5mL超純水平衡；用5%氨水將樣品溶液的pH調(diào)至8，上樣量為1mL；用2mL超純水淋洗雜質(zhì)；用6%鹽酸洗脫有機(jī)酸，洗脫體積為1.5mL，洗脫速度為1mL/min[6]。

1.2.2.3 Supelclean LC-NH2固相小柱 操作方法同1.2.2.2中LC-SAX小柱。

1.2.2.4 活性炭 取5mL樣品，加入0.25g活性炭粉脫色30min，雙層濾紙過濾后再用0.22μm微孔濾膜過濾。

經(jīng)過上述方法處理的樣品分別進(jìn)行HPLC分析，測(cè)定有機(jī)酸的加標(biāo)回收率。

1.2.3 加標(biāo)回收率的計(jì)算 分別取5mL不同總酸含量（4.5、5.0、5.5、6.0g/100mL）的醋樣，加入5mL已知濃度的有機(jī)酸標(biāo)樣，分別按照上述確定的沉淀、除雜方法進(jìn)行處理后進(jìn)行HPLC分析，計(jì)算有機(jī)酸的加標(biāo)回收率。

式中：x，加標(biāo)回收率（%）；C1，醋樣中有機(jī)酸的濃度（g/100mL）；C2，加標(biāo)醋樣中有機(jī)酸的濃度（g/100mL）；C0，有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)液濃度（g/100mL）；V0，加標(biāo)體積（mL）；V，加標(biāo)后醋樣總體積（mL）。

1.2.4 HPLC分析條件 色譜柱，Waters Atlantis d C18（4.6mm×150mm×5μm）；柱溫，30℃；流動(dòng)相，20mmol/L NaH2PO4，用磷酸調(diào)pH至2.7；進(jìn)樣體積10μL；流速0.7mL/min；檢測(cè)器UV波長(zhǎng)210nm。

以保留時(shí)間和樣品加標(biāo)定性，將各種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在同樣的色譜條件下分別進(jìn)樣，繪制有機(jī)酸濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用峰面積外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 沉淀劑的選擇

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，亞鐵氰化鉀-硫酸鋅沉淀法（圖1b）和亞鐵氰化鉀-乙酸鋅沉淀法（圖1c）均可有效地沉淀蛋白質(zhì)，且易于過濾，對(duì)所測(cè)有機(jī)酸的吸附??；乙醇沉淀法（圖1d）使醋樣中各有機(jī)酸的分離度不好，特別是乳酸和乙酸；三氯乙酸法（圖1e）處理醋樣后，部分有機(jī)酸的分離度、對(duì)稱因子較差，影響定性與定量。

圖1 不同沉淀法處理后醋樣有機(jī)酸的HPLC色譜圖Fig.1 Chromatograms of organic acids in vinegars after precipitation

采用亞鐵氰化鉀-硫酸鋅沉淀法時(shí)，不同總酸含量的食醋有機(jī)酸加標(biāo)回收率為90.2%～110.0%（表1），說明該沉淀法適用于不同酸度食醋的有機(jī)酸分析。而采用亞鐵氰化鉀-乙酸鋅法時(shí)，酒石酸與乳酸回收率較低，分別為65.4%～70.3%和50.1%～53.4%；另外，由于乙酸鋅溶液里含有乙酸根，需要設(shè)置空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)并計(jì)算去除相應(yīng)的濃度。根據(jù)圖1結(jié)果，采用乙醇處理和三氯乙酸處理時(shí)，醋樣中各有機(jī)酸的分離度不高，因此未對(duì)這兩種預(yù)處理方法進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)。綜上，亞鐵氰化鉀-硫酸鋅法具有沉淀能力強(qiáng)、對(duì)有機(jī)酸分析干擾小、穩(wěn)定性好、適用于不同酸度醋樣的優(yōu)點(diǎn)，因此本實(shí)驗(yàn)選用該沉淀法用于去除醋樣中大分子雜質(zhì)。

表1 不同沉淀處理對(duì)食醋有機(jī)酸加標(biāo)回收率的影響Table 1 Effect of precipitation on recoveries of organic acids in vinegars

2.2 小分子雜質(zhì)去除方法的比較

有機(jī)酸的前處理一般可采用液液萃取技術(shù)，以除去干擾物，但液液萃取時(shí)間長(zhǎng)，需使用有機(jī)溶劑，不利于環(huán)境和健康[7-8]。本實(shí)驗(yàn)考察了不同固相萃取小柱及活性炭對(duì)醋樣中小分子雜質(zhì)的去除效果和有機(jī)酸加標(biāo)回收率的影響。

結(jié)果表明（表2），C18固相萃取小柱對(duì)醋樣的脫色效果較好，處理后樣品呈無色透明狀，不同酸度醋樣的有機(jī)酸加標(biāo)回收率都比較高。

LC-SAX是以硅膠為基質(zhì)的強(qiáng)陰離子交換萃取柱，適合弱酸的提取。LC-NH2是以硅膠為基質(zhì)的氨丙基萃取柱，具有極性固定相和弱陰離子交換劑，可通過極性吸附或陰離子交換達(dá)到保留作用，因此具有雙重作用。用LC-SAX、LC-NH2兩種小柱色譜圖中各有機(jī)酸分離較好，雜質(zhì)干擾小，但是處理樣品時(shí)間較長(zhǎng)，不同有機(jī)酸的回收率均不理想（表2）；除了α-酮戊二酸的回收率能達(dá)到85%以上，其余的有機(jī)酸回收率普遍偏低，而且不同酸度醋樣的有機(jī)酸回收率相差較大。

活性炭具有較強(qiáng)的吸附作用，能夠吸附各種有機(jī)物和色素，經(jīng)過活性炭脫色的樣品溶液無色透明，樣品色譜圖中各有機(jī)酸分離度較好（色譜圖未給出），但是大部分有機(jī)酸的回收率偏低（表2）。表明活性炭的吸附能力太強(qiáng)，吸附雜質(zhì)的同時(shí)，幾乎所有的有機(jī)酸被吸附，其含量都有不同程度的下降，因此本法不宜采用。

綜上，本實(shí)驗(yàn)選用Sep-Pak C18固相萃取小柱處理醋樣，以排除色素等小分子雜質(zhì)。

表2 不同固相萃取小柱回收率的比較Table 2 Recoveries of organic acids in vinegars

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)確定的食醋預(yù)處理方法為：取5mL醋樣置于100mL容量瓶中，分別加入2mL亞鐵氰化鉀（10.6%）和2mL硫酸鋅（30%），搖勻后用超純水定容，靜置0.5h后用雙層濾紙過濾。濾液用0.22μm微孔濾膜過濾，然后采用Sep-Pak C18固相萃取小柱處理，所得溶液用于有機(jī)酸的HPLC分析。該預(yù)處理方法簡(jiǎn)單，操作方便，成功地排除了食醋中蛋白、色素等雜質(zhì)對(duì)有機(jī)酸HPLC分析的干擾。

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