肝素-殼聚糖親和層析純化豬凝血酶研究

何曉梅，韋傳寶，張業(yè)峰

（1.皖西學院生物與制藥工程學院，安徽六安 237012；2.皖西學院安徽省植物生物技術實驗實訓中心，安徽六安237012）

凝血酶（thrombin）是一種由凝血酶前體形成的多功能絲氨酸蛋白水解酶，催化血纖維蛋白原變成血纖維蛋白而促使血液凝固。在臨床上，凝血酶適用于結扎止血困難的小血管、毛細血管以及實質性臟器出血的止血等。我國的豬血資源豐富，從中提純凝血酶有很大的經(jīng)濟效益。目前，對凝血酶的分離純化主要采用離子交換層析、凝膠過濾和親和層析，與其他生化分離方法相比，親和層析技術具有高收率、高純度、能保持生物大分子天然狀態(tài)等優(yōu)點。目前親和層析使用的載體如（瓊脂糖）存在價格昂貴，機械強度低，易壓床，配基的偶聯(lián)條件激烈，配基與載體結合力不強易脫落等缺點[1]。殼聚糖是一種天然多糖衍生物，具有良好的生物親和性、生物可降解性，其分子鏈上豐富的氨基和羥基使其容易進行化學修飾而賦予多種功能，已在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、輕紡、日化等領域得到廣泛應用[2-7]。但是由于天然狀態(tài)的殼聚糖大部分為粉末狀，作為吸附載體，則使載體和吸附物都難以回收，從而限制其使用[8]。將殼聚糖制備成幾何形態(tài)、分散性、溶脹性、機械強度均良好的高分子球珠，使殼聚糖和高分子球珠的功能相復合，可使其在生物工程、醫(yī)藥化工等領域得到更大的應用[9-12]。本文采取以殼聚糖為原料，液體石蠟為有機分散介質，乙酸乙醋為致孔劑，甲醛、戊二醛為交聯(lián)劑，運用反相懸浮交聯(lián)法，通過單因素實驗，優(yōu)化制珠條件并獲得最優(yōu)方案，利用化學方法成功的將分子量范圍在6ku左右的肝素，連接到在強堿條件下經(jīng)環(huán)氧氯丙烷、二甲亞砜活化后并在EDC存在的環(huán)境條件下的殼聚糖球珠上，制成了親和吸附劑，取得了十分良好的效果，且大大縮短了純化時間和減少了洗脫液的用量。使用天然廉價的殼聚糖作為載體，大大降低了操作成本，對于今后大規(guī)模制備高純度的凝血酶有較好的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮豬血 取自西商食品有限公司屠宰場，加入3.8%的檸檬酸鈉作為抗凝劑，-20℃冷藏；殼聚糖，液體石蠟，DMSO（二甲基亞砜），ECH（環(huán)氧氯丙烷），EDC（1-乙基-3-二甲氨丙基-碳二亞胺），肝素，甲醛，戊二醛，司盤80，PEG8000等。

76-1型玻璃恒溫水浴，JJ100型電子天平，2XZ-2X型旋片真空泵，索氏提取器，HH-4型數(shù)碼顯示水浴鍋，CHA-S恒溫振蕩器，通風柜系統(tǒng)，YC-1型冷凍層析柜，高速臺式離心機，磁力攪拌器，SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵，722型分光光度計。

1.2 實驗方法

1.2.1 殼聚糖球珠的制備 稱取5.0g殼聚糖溶于100mL 3%冰醋酸溶液中，用玻璃棒攪拌至無明顯粉末狀時停止，靜置過夜使其充分溶解。向裝有攪拌器和溫度計的250mL三口燒瓶中依次加入66.7mL液體石蠟，15mL乙酸乙酯，8滴Span80，攪拌30min，加入溶解好的殼聚糖溶液，啟動水浴鍋加熱至三口瓶內(nèi)溫度達50℃，攪拌60min，用注射器緩慢加入適量甲醛溶液，升溫至55℃，反應30min，再使用注射器緩慢加入適量戊二醛溶液，升溫至60℃，用1mol/L NaOH溶液調(diào)pH至9.0，反應2.0h，迅速用真空泵抽濾，蒸餾水反復洗滌，將球珠放入索氏提取裝置中分別先后用石油醚、無水乙醇抽提至少12h，最后放入真空干燥箱中60℃干燥至恒重，用研缽輕研至均勻球珠。

1.2.2 肝素-殼聚糖親和吸附劑的制備

1.2.2.1 殼聚糖球珠的活化 取5g干殼聚糖球珠，雙蒸水充分溶脹24h，真空抽干，然后依次加入12mL DMSO、6mL ECH和12mL 2mol/L NaOH溶液，殼聚糖球珠的懸浮液于恒溫空氣浴搖床上170r/min、40℃振蕩反應2h。反應結束后，用去離子水洗去未反應的試劑。

1.2.2.2 殼聚糖球珠的偶聯(lián) 向活化的球珠中加入肝素（168g/L），用0.1mol/L HCl調(diào)pH至4.75[13]，緩慢加入3%EDC，4℃下緩慢攪拌過夜，結束后用0.1mol/L NaOH溶液和去離子水交替洗滌至中性，即得殼聚糖親和吸附劑[14]。

1.2.3 豬凝血酶粗品的制備 -20℃冷藏8%檸檬酸鈉抗凝的新鮮豬血漿，4℃恒溫溶解，用蒸餾水將其稀釋10倍后，用0.2mol/L冰醋酸調(diào)節(jié)pH為5.3，于4℃下放置過夜，通過虹吸去除上清液，3400r/min離心15min收集凝血酶原沉淀，沉淀物溶于含0.075%草酸鉀的0.9%NaCl溶液，于磁力攪拌器上攪拌溶解1h，3400r/min離心15min，收集上清液，向上清液中加入終濃度為0.1mol/L CaCl2溶液，25℃下激活2h，即得豬凝血酶粗酶液[15]。

1.2.4 豬凝血酶的親和層析 肝素-殼聚糖親和吸附劑經(jīng)蒸餾水充分溶脹裝柱（1m×15cm），用0.05mol/L，pH7.5 Tris-HCl緩沖液平衡柱床，將凝血酶粗酶液上樣，控制流速為12mL/h，然后用同樣的緩沖液進行洗滌至無蛋白質流出為止，依次換用含0.5mol/L和3.0mol/L NaCl的緩沖液洗脫，分別收集相對應的洗脫液，做好標記。

1.2.5 凝血酶活性檢測

1.2.5.1 凝血酶活性的定性檢測 用0.05mol/L，pH7.5 Tris-HCl溶液稀釋粗凝血酶液至1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，然后分別加入等量的新鮮豬血漿，并迅速放入37℃恒溫箱中，1～1.5h后觀察凝固情況。

1.2.5.2 凝血酶活性的定量測定 活性測定采用中國藥典介紹的方法[16]，凝血酶標準品用0.9%NaCl溶液分別制成每毫升中含5.0單位、6.4單位、8.0單位、10.0單位的標準品溶液。取內(nèi)徑1cm、長10cm的試管4支，各精密加入含0.1%可凝物的纖維蛋白原溶液0.9mL，置于（37±0.2）℃水浴中保溫5min，再分別精密量取上述4種濃度的標準品溶液各0.1mL，迅速加入上述各試管中，搖勻、立即計時，在（37±0.2）℃水浴中，觀察并記錄纖維蛋白原的初凝時間，每種濃度測5次，求平均值。標準品溶液的濃度應控制凝結時間在14～60s之間為宜。在雙對數(shù)坐標紙上，以每管中標準品實際單位數(shù)（U）為橫坐標，凝結時間（s）為縱坐標，繪制標準曲線，求得回歸方程。樣品測定方法同上，通過回歸方程求得樣品中凝血酶的活力。

1.2.5.3 蛋白質濃度測定 采用Lowry法[17]。

2 結果與分析

2.1 殼聚糖球珠制備的條件優(yōu)化

2.1.1 殼聚糖溶液濃度與球珠的關系 保持殼聚糖溶液與液體石蠟的體積比1.5∶1不變，甲醛10mL、戊二醛2mL、乙酸乙酯15mL、Span80 8滴，其他條件不變，改變殼聚糖溶液的濃度分別為1.5%、2.5%、3.5%、5.0%、6.5%進行實驗，結果如表1所示。

表1 殼聚糖溶液濃度與球珠的關系Table 1 Relationship between chitosan concentration and bead features

由表1可以看出，隨著殼聚糖溶液濃度的增大，球珠的顏色加深、粒度增大，成球性與均勻性逐步提高，但是殼聚糖溶液濃度過大則出現(xiàn)塊狀物（如圖1a所示）。由于濃度增大，水相粘度提高，互相聚集不宜分散導致球珠粒度增大。同時由于球珠的表面積越小，單位表面積交聯(lián)的甲醛、戊二醛就越多，導致球珠顏色越深。經(jīng)觀察若想獲得粒度均勻、單分散性好的球珠（如圖1b所示），最佳殼聚糖濃度控制在5.0%左右。

圖1 不同殼聚糖濃度制備的殼聚糖球珠結構（生物顯微鏡放大100倍）Fig.1 Structure of chitosan beads prepared with different chitosan concentration（100×）

圖2 不同攪拌速度制備的殼聚糖球珠結構（生物顯微鏡放大100倍）Fig.2 Structure of chitosan beads prepared with different stirring speeds（100×）

2.1.2 攪拌速度與球珠的關系 保持殼聚糖溶液與液體石蠟的體積比1.5∶1不變，甲醛10mL、戊二醛2mL、乙酸乙酯15mL、Span80 8滴，殼聚糖溶液濃度為5.0%，其他條件不變，改變攪拌速度進行實驗，結果如表2所示。

由表2可以看出，隨著攪拌速度的增加，球珠的粒度逐步減小，但過高的攪拌速度造成粒度過?。ㄈ鐖D2a所示）。經(jīng)觀察欲獲得粒度均勻、單分散性好的球珠（如圖2b所示），攪拌速度控制在2500r/min左右。

表2 攪拌速度與球珠的關系Table 2 Relationship between stirring speeds and bead features

2.1.3 交聯(lián)劑與殼聚糖球珠的關系 保持殼聚糖溶液與液體石蠟的體積比1.5∶1不變，乙酸乙酯15mL、Span80 8滴、殼聚糖溶液濃度5%、轉速2500r/min，其他條件不變，改變交聯(lián)劑甲醛和戊二醛用量進行實驗，結果如表3所示。

由表3可以看出固化交聯(lián)劑甲醛和戊二醛的用量對球珠的粒度和色澤都有一定影響。戊二醛用量增大，產(chǎn)物顏色加深，而戊二醛用量增大也使產(chǎn)物相互粘著嚴重，甚至出現(xiàn)“塊狀”現(xiàn)象（如圖3a所示）。甲醛用量的變化對產(chǎn)物特性影響較小。經(jīng)觀察欲獲得粒度均勻、單分散性好的球珠（如圖3b所示），最佳甲醛與戊二醛用量比例為5∶1。

表3 交聯(lián)劑用量與殼聚糖球珠的關系Table 3 Relationship between cross-linker doses and bead features

圖3 不同交聯(lián)劑用量制備的殼聚糖球珠結構（生物顯微鏡放大100倍）Fig.3 Structure of chitosan beads prepared with different cross-linker doses（100×）

2.1.4 溶脹時間與殼聚糖球珠多孔性的關系 稱取一定量制備好的球珠放入ddH2O中，進行溶脹，分別在5、15、24、36h時取出放在生物顯微鏡下觀察球珠的多孔性，結果如表4所示。

表4 溶脹時間與球珠多孔性的關系Table 4 Relationship between swelling time and bead porosity

由表4可以看出，隨著溶脹時間的延長，球珠的多孔性逐步顯現(xiàn)出來，用ddH2O溶脹15h只能看到極少的球珠呈現(xiàn)多孔性（見圖4a）。隨著溶脹時間的延長，球珠的多孔性越來越明顯。經(jīng)觀察欲使球珠完全溶脹即多孔性完全呈現(xiàn)（＞99%），則至少控制溶脹時間在24h（見圖4b）。

圖4 不同溶脹時間與殼聚糖球珠多孔性的關系（生物顯微鏡放大400倍）Fig.4 Relationship between swelling time and bead porosity（400×）

圖5 肝素-殼聚糖球珠親和吸附豬凝血酶洗脫曲線Fig.5 Elution curve of porcine thrombin by affinity chromatography of heparin-chitosan beads

2.2 豬粗凝血酶的親和層析純化

2.2.1 殼聚糖親和吸附劑性能檢測 在4℃條件下，取適量的親和層析樹脂和激活好的粗凝血酶，放入500mL燒杯中，在磁力攪拌器上緩慢攪拌，使二者充分吸附，3h后停止攪拌，靜置一段時間，取上層溶液適量，與血漿混勻，對照組取等量粗凝血酶與血漿混勻，二者迅速放入37℃恒溫水浴中，1～1.5h后觀察。實驗組血漿不凝固，對照組血漿凝固，初步表明殼聚糖親和吸附劑對豬凝血酶具有特異性吸附作用。

2.2.2 粗凝血酶的親和層析純化 將凝血酶粗品上樣到事先用pH7.5 0.05mol/l Tris-HCl緩沖液平衡好的柱（1m×15cm）上，控制流速為12mL/h，至無蛋白流出為止，然后分別換用含0.5mol/L和3.0mol/L NaCl的pH7.5 0.05mol/L Tris-HCl洗脫，洗脫曲線如圖5所示。分別按起始方向依次取第1、2、3峰收集液一定量，加入新鮮豬血混勻，37℃保溫1h，觀察是否凝集。結果表明，第1、3峰收集液不能使豬血漿凝固，確定為雜蛋白，第2個洗脫峰收集液能使豬血漿凝固，確定為凝血酶。將凝血酶收集液用PEG8000濃縮，真空冷凍干燥，即得凝血酶制品。從表5可知，粗凝血酶經(jīng)肝素-殼聚糖球珠親和層析純化得到凝血酶制品具有較高的比活，達到1801.9U/mg，回收率可達81%，純化倍數(shù)為11.37。

表5 豬凝血酶的親和層析Table 5 Purification of thrombin by heparin-Chitosan beads affinity chromatography

2.3 肝素-殼聚糖親和吸附劑的重復使用性能

收集吸附過凝血酶的殼聚糖球珠，用1.0mol/L NaOH為洗脫劑，洗到上清液中檢測不到蛋白質為止，再以3～6倍柱床體積的0.5mol·L-1NaCl/0.1mol·L-1Tris-HCl（pH8.5）和0.5mol·L-1NaCl/0.1mol·L-1NaAc（pH4.5）依次反復沖洗3～4次，進行再生后，用0.05mol/L pH7.5 Tris-HCl緩沖液充分平衡，然后在相同實驗條件下進行凝血酶吸附實驗。實驗表明，殼聚糖球珠對凝血酶的吸附量幾乎可以完全恢復，表明此殼聚糖球珠的重復使用性能良好。

3 結論

3.1 通過采用液體石蠟作為有機分散介質，乙酸乙酯作為制孔劑，Span80為乳化劑，甲醛、戊二醛為交聯(lián)劑，利用反相懸液交聯(lián)法制備殼聚糖球珠。單因素實驗結果表明，制備比較理想的微米級殼聚糖球珠的最佳條件是：5%殼聚糖溶液112.5mL、液體石蠟75mL、乙酸乙酯15mL、甲醛10mL、戊二醛2mL、Span80 8滴、轉速2500r/min。在此實驗條件下制得的殼聚糖球珠呈淡黃色、大小均勻、分散性好。用ddH2O溶脹24h，具有明顯的多孔性。

3.2 將制得的殼聚糖球珠經(jīng)環(huán)氧氯丙烷活化，在EDC存在條件下偶聯(lián)上小分子量的肝素制備的親和吸附劑，能夠吸附豬凝血酶，并且易于洗脫，保持了凝血酶活性。該吸附劑具有易于活化，無毒，無明顯壓床，價格低廉的優(yōu)點。

3.3 本實驗定性研究了肝素-殼聚糖親和吸附劑純化豬凝血酶，為今后大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)高純度豬凝血酶提供理論依據(jù)。

[1]肖麗霞，姜涌明.兩種不同的親和吸附劑對豬凝血酶純化效果的比較[J].揚州大學學報，2001（8）：55-57.

[2]將挺大.殼聚糖[M].北京：化學工業(yè)出版社，2003（3）：256-258.

[3]李學斌，祝華.殼聚糖微球的制備方法研究[J].藥學進展，2005，29（4）：166-169.

[4]丁明，施建軍，皇甫立霞，等.殼聚糖球珠的制備研究[J].化學世界，1998（12）：636-640.

[5]丁世敏，封享華.交聯(lián)殼聚糖多孔微球對染料的吸附平衡及吸附動力學分析[J].分析科學學報，2005，21（2）：127-130.

[6]李志洲，劉軍強，劉軍海.多孔殼聚糖球珠的制備及其在污水處理中的應用[J].化工科技，2008，16（1）：27-31.

[7]王芳，韓德艷，張海麗.殼聚糖磁性微球的制備及其對牛血清白蛋白的吸附性能研究[J].化學與生物工程，2007，24（8）：41-44.

[8]李志洲，劉軍強.多孔殼聚糖球珠的制備研究[J].淮陰師范學院學報，2007（8）：246-249.

[9]葛亞芳，李明春，辛梅華，等.殼聚糖固載環(huán)糊精球珠的制備及吸附硝基酚[J].化工進展，2010（2）：233-237.

[10]丁明，孫虹，康玲，等.殼聚糖微球的制備研究[J].合肥聯(lián)合大學學報，1999（2）：7-11.

[11]Zhao K S，Asami K，Lei J P.Dielectric analysis of chitosan microsphere suspensions：study on its ion adsorption[J].Colloid Polymer Sci，2002，280：1038-1044.

[12]Xu J H，Li S W，Tostado C，et al.Preparation of Monodispersed Chitosan Microspheres and in situ Encapsulation of BSA in a Co-axial Microfluidic Device[J].Biomed Microdevices，2008，11（1）：243-249.

[13]Matsumoto I，Mizuno Y，Seno N.Activation of sepharose with epichlorohydrin and subsequent immobilization of ligand for affinity adsorbent[J].J Biochem，1979，85（4）：1091-1098.

[14]李梅基，李昭華，胡建成，等.用殼聚糖親和磁性球珠純化血漿凝血酶的研究[J].生物化學與生物物理進展，2010，37（4）：433-440.

[15]南雪梅，董文賓.豬血凝血酶制備工藝[J].食品科技，2010，35（8）：167-170.

[16]中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國藥典[J].第二部.北京：化學工業(yè)出版社，1995：1128-1129.

[17]Lowry O H.Protein measurement with the folin phenol reagent[J].J Biol Chem，1951，193：265-275.