低溫沉淀法提取高純度蛋黃卵磷脂的工藝研究

肖文婷，張 帆，李 燕，范杰平，朱建航，*

(1.南昌大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院低碳生物技術(shù)研究中心，江西南昌330031;2.南昌大學(xué)生命與食品科學(xué)學(xué)院，江西南昌330029)

卵磷脂(lecithin)是一種從植物或動(dòng)物中提取出來的磷脂混合物，主要包括磷脂酰膽堿(phosphotidylcholine，簡稱 PC)、磷 脂酰乙醇胺(phosphotidylethanolamine，簡稱 PE)、磷脂酰肌醇(phosphotidylinositol，簡 稱 PI)、磷 脂 酰 絲 氨 酸(phosphotidylserine，簡稱PS)等幾種組分，具有重要的生理活性［1］，被廣泛應(yīng)用于食品加工、醫(yī)療保健、飼料加工、化妝品行業(yè)［2－4］。卵磷脂主要來源于大豆和蛋黃，蛋黃卵磷脂中磷脂酰膽堿含量高于大豆3倍，且氧化穩(wěn)定性更好，所以近年來蛋黃卵磷脂的功能研究和應(yīng)用開發(fā)日益受到人們的關(guān)注［5］。目前蛋黃卵磷脂的制備方法主要有溶劑提取法、金屬離子沉淀法、超臨界萃取法、柱層析法、膜分離法、酶催化法等［1］，且以溶劑提取法最具工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。1981年Larsen等［6］以單一溶劑提取蛋黃卵磷脂，提取率可達(dá)71.6%(換算成得率為7.20%)，但純度僅為51.4%，限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用。此后謝憲章等［7］采用二元混合溶劑提取蛋黃卵磷脂，提取率和純度均優(yōu)于單一溶劑，但該工藝毒性溶劑殘留較大。為改善溶劑殘留問題，Sim［8］以乙醇為溶劑，并結(jié)合低溫冷藏去除甘油三酯，制得純度為82%的卵磷脂，雖然該方法可有效控制有毒溶劑的殘留，但產(chǎn)品膽固醇含量較高，磷脂組分的純度偏低。為進(jìn)一步提高產(chǎn)品純度，Palacios［9］用4℃丙酮去除膽固醇和中性油脂，使純度達(dá)90%以上，但該工藝操作步驟較多，溶劑用量大，提取率不高，實(shí)際生產(chǎn)過程中也受到一定的限制。因此，開發(fā)簡單易行、高附加值的高純蛋黃卵磷脂提取工藝已成為亟待解決的研究熱點(diǎn)。本研究以鴨蛋蛋黃液為原料，利用低溫沉淀法提取高純度蛋黃卵磷脂，探討了各因素對卵磷脂得率和純度的影響，通過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化分析，得到了最佳提取工藝條件。與傳統(tǒng)工藝相比，該工藝操作簡便、提取率高、節(jié)約成本，可為蛋黃卵磷脂的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮鴨蛋 市購;磷脂酰膽堿(PC)標(biāo)準(zhǔn)品、磷脂酰乙醇胺(PE)標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma公司;無水乙醇、正己烷、丙酮、鉬酸銨、鹽酸 分析純，市購;甲醇、乙腈色譜純，市購;分析用水 二次蒸餾水，自制。

BSA124S電子分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;85－2型恒溫磁力攪拌器 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;RE－52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申生科技有限公司;MDF－U333超低溫冰箱 SANYO Electric Biomedical Co.，Ltd.;UV762紫外可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;DZF－6050型真空干燥箱 上海一恒科技有限公司;Agilent 1100高效液相色譜儀 美國Agilent公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 稱取一定量鴨蛋蛋黃液，加入適量無水乙醇，在25℃恒溫?cái)嚢钘l件下提取30min后，過濾，濾渣重復(fù)以上步驟兩次。收集上清液，減壓蒸餾至近干，先加入適量正己烷使其完全溶解，再加入一定比例丙酮，然后放入超低溫冰箱中冷凍12h取出，傾注分離出沉淀物，經(jīng)低溫丙酮洗滌數(shù)次，真空干燥，得高純度蛋黃卵磷脂，稱重，檢測。

1.2.2 磷脂含量測定 采用定磷比色法［10］測定含磷量，使用系數(shù)25將含磷量換算為磷脂的含量［11］。計(jì)算公式為:

式中:P－標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的含磷量(mg);n－稀釋倍數(shù);m－試樣質(zhì)量(g);25－每毫克磷相當(dāng)于磷脂的毫克數(shù)。

1.2.3 HPLC檢測 采用高效液相色譜法測定樣品純度［12－15］。采用外標(biāo)法定量，計(jì)算樣品中 PC、PE 組分含量。色譜條件為色譜柱:Sinochrom Si 60柱(4.6mm ×250mm，5μm);流動(dòng)相:乙腈－甲醇－85%磷酸(7∶2∶0.09，v/v);流速:1.0mL/min;柱溫:30℃;紫外檢測波長:210nm;進(jìn)樣量:10μL。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 蛋黃卵磷脂的提取受到諸多因素的影響，本文以卵磷脂得率和磷脂含量為衡量指標(biāo)，研究料液比、己烷－丙酮體積比、冷凍溫度等因素對卵磷脂提取效果的影響。在單因素實(shí)驗(yàn)中，料液比(g/mL)設(shè)定為 1∶3、1∶3.5、1∶4、1∶4.5、1∶5;己烷－丙酮體積比為 1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3、1∶3.5;冷凍溫度為－40、－30、－20、－10、0℃，通過單因素實(shí)驗(yàn)對提取工藝初步優(yōu)化。為獲得最佳提取工藝條件，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)L9(34)(見表1)，分析結(jié)果確定提取高純度蛋黃卵磷脂的最佳工藝條件?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)，確定評價(jià)指標(biāo)中權(quán)重關(guān)系為綜合指標(biāo)Z=0.6×磷脂含量+0.4×得率［16］，即 Z=0.6X+0.4Y。

表1 正交因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal design

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 料液比對蛋黃磷脂提取效果的影響 在己烷－丙酮體積比1∶2.5，冷凍溫度－20℃條件下，考察了提取過程中料液比對卵磷脂得率和含量的影響，結(jié)果見圖1。隨著料液比的增大，卵磷脂得率和磷脂含量均有明顯上升。這是因?yàn)樵龃笕軇┯昧考丛龃罅说包S液與乙醇溶劑的接觸面積，促進(jìn)了蛋黃中磷脂的溶解。當(dāng)料液比達(dá)1∶4(g/mL)后得率和磷脂含量上升趨勢逐漸減小，且磷脂含量于1∶4.5(g/mL)處達(dá)到最大值。綜合考慮，實(shí)驗(yàn)選擇的料液比為1∶4.5(g/mL)。

圖1 料液比對提取效果的影響Fig.1 Influence of egg yolk－ethanol ratio on extraction effect

2.1.2 己烷－丙酮體積比對蛋黃磷脂提取效果的影響 在料液比1∶4.5(g/mL)，冷凍溫度－20℃條件下，考察了己烷－丙酮體積比對卵磷脂得率和含量的影響，結(jié)果見圖2。隨著己烷－丙酮體積比減小，卵磷脂得率是先增后減，于1∶2.5時(shí)達(dá)到最大值;而磷脂含量逐漸增加，增加幅度越來越小。這可能是因?yàn)殡S著體積比減小，己烷－丙酮體系體積變大，卵磷脂及中性脂質(zhì)部分溶解，且中性脂質(zhì)溶解量比卵磷脂更大，導(dǎo)致卵磷脂得率下降，含量上升?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)中的溶劑成本，實(shí)驗(yàn)選擇己烷－丙酮體積比為1∶2.5。

圖2 己烷－丙酮體積比對提取效果的影響Fig.2 Influence of hexane－acetone volume ratio on extraction effect

2.1.3 冷凍溫度對蛋黃磷脂提取效果的影響 在料液比1∶4.5(g/mL)，己烷－丙酮體積比1∶2.5的條件下，考察了冷凍溫度對卵磷脂得率和含量的影響，結(jié)果見圖3。隨著冷凍溫度升高，卵磷脂得率逐漸降低，且降低幅度逐漸增大;而磷脂含量先升高后降低，在－20℃時(shí)達(dá)到最大值。這可能是在低溫條件下中性脂質(zhì)和磷脂在己烷－丙酮溶劑體系中的溶解性相互作用和影響造成的［17］。在溫度低于－20℃時(shí)，其他油脂類物質(zhì)的溶解度隨溫度變化更顯著，導(dǎo)致溫度升高時(shí)，得率略有降低，含量有所提高;在溫度高于－20℃時(shí)，卵磷脂的溶解度隨溫度變化更顯著，導(dǎo)致溫度升高時(shí)，卵磷脂在溶劑中溶解度增大，從而得率和含量都急劇下降。綜合考慮，實(shí)驗(yàn)選擇冷凍溫度為－20℃。

圖3 冷凍溫度對提取效果的影響Fig.3 Influence of frozen temperature on extraction effect

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝條件。綜合考察料液比、己烷－丙酮體積比、冷凍溫度三個(gè)因素的影響，按照L9(34)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal design

由表2可知，影響卵磷脂得率和含量的因素主次順序?yàn)?C(冷凍溫度)＞A(料液比)＞B(己烷－丙酮體積比)。通過極差分析得到最佳工藝條件:A2B3C2，即料液比 1∶4.5，己烷－丙酮體積比 1∶3，冷凍溫度－20℃。從極差值可以看出，己烷－丙酮體積比對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較小，綜合考慮實(shí)際生產(chǎn)成本，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)選擇的條件為:料液比1∶4.5，己烷－丙酮體積比1∶2.5，冷凍溫度－20℃，進(jìn)行3組重復(fù)實(shí)驗(yàn)后，測得產(chǎn)品得率為9.37%，磷脂含量為97.68%。

2.3 HPLC檢測結(jié)果

利用高效液相對標(biāo)準(zhǔn)品及樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖4。

圖4 高效液相色譜圖Fig.4 The HPLC Chromatogram

由圖4可以看出，在8.6和9.2min左右，PC標(biāo)準(zhǔn)品和樣品均出現(xiàn)兩個(gè)峰，這是因?yàn)镻C本身是混合物，其R2位置上存在多種基團(tuán)，如油酸、亞油酸、花生四烯酸等，導(dǎo)致PC中存在多種單質(zhì)，如1－棕櫚酸－2－二花生四烯酸磷脂酰膽堿、1，2－花生四烯酸磷脂酰膽堿、1，2－二亞油基磷脂酰膽堿等［18－19］。由于這些單質(zhì)在結(jié)構(gòu)上存在微小差別，造成出峰時(shí)間有一定差異，從而出現(xiàn)上圖中的峰形。

樣品中主要組分的峰形和PC、PE標(biāo)準(zhǔn)品基本一致，表明樣品主要組分為PC和PE，通過外標(biāo)法定量測得PC含量為77.42%，PE含量為18.47%。

3 結(jié)論

研究了料液比、己烷－丙酮體積比、冷凍溫度對蛋黃卵磷脂提取效果的影響，并通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，得到最佳工藝條件:料液比1∶4.5(g/mL)，己烷－丙酮體積比1∶2.5，冷凍溫度－20℃，該條件下產(chǎn)品的得率可達(dá)9.37%，磷脂含量為97.68%。采用高效液相色譜法對樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果表明樣品中PC和PE組分含量分別為77.42%和18.47%。本工藝具有操作簡單、提取效果好、成本低等優(yōu)點(diǎn)，對工業(yè)化生產(chǎn)鴨蛋黃卵磷脂有著重要的參考價(jià)值和指導(dǎo)意義。

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