鼎湖鱗傘多糖的提取工藝及體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)活性的研究

李作美，柯春林，曾曉雄

(1.蚌埠學(xué)院生物與食品工程系，安徽蚌埠233000;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京210095)

鼎湖鱗傘(Pholiota dinghuensis Bi)是一種大型真菌，位于廣東鼎湖山慶云寺附近，生境在闊葉林中凸脈榕和韶子活樹干上或基部群生、簇生［1］。該種為中國特有種［2］。食藥用真菌作為藥物在我國已經(jīng)具有悠久的歷史，早在兩千多年前的東漢末期，世界上第一部藥物專著《神農(nóng)本草經(jīng)》中就記載了靈芝、茯苓、豬苓等真菌的藥用功效［3］。明代著名的醫(yī)藥學(xué)家李時珍編著的《本草綱目》，載藥1892種，據(jù)不完全統(tǒng)計，其中有藥用真菌40余種，如香菇、馬勃、豬苓、茯苓、木耳等，并進行了簡單的分類，將真菌藥材大部分收載于菜部卷中，說明他那時就已注意到有些藥用真菌同時具有食用價值［3－4］。經(jīng)大量研究表明，絕大多數(shù)真菌多糖都具有免疫調(diào)節(jié)作用［5－7］。如銀耳多糖、靈芝多糖、香菇多糖等的免疫調(diào)節(jié)活性比較明顯。新疆阿魏菇能有效增強小鼠的體液免疫功能，且有劑量依賴關(guān)系［8］。茯苓多糖在臨床上不僅是一種較好的免疫增強劑，而且能抗胸腺萎縮，減少脾臟增大，對免疫器官有很好的保護作用［9］。目前國內(nèi)外有關(guān)鼎湖鱗傘的研究報告很少。本文對鼎湖鱗傘多糖(polysaccharide from Pholiota dinghuensis Bi，PFPD)的免疫調(diào)節(jié)活性進行了研究，旨在為今后研發(fā)出新的天然藥物或保健品等方面，提供一定的實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鼎湖鱗傘粗多糖 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院酶工程實驗室制備;雌性昆明種小白鼠 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心(北京);小鼠用實驗動物飼料 江蘇協(xié)同生物工程有限公司;綿羊全血及豚鼠血清 上海川翔生物科技有限公司;無水乙醇、丙酮 均為分析純試劑;純凈水 購于蘇果超市;環(huán)磷酰胺 江蘇恒瑞制藥有限公司;溶菌酶(LZM) 南京建成生物工程研究所;二硝基氟苯 江蘇恒瑞制藥有限公司;鹽酸左旋米唑購于濟南奧德凱藥業(yè)有限公司;RPMI1640培養(yǎng)基 上海生工生物工程有限公司。

HH－4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇國華電器有限公司;HY－08高速粉碎機、DHG－9030A型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司;Heidolph Laborota 4000真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國Heidolph;AY－120電子精密天平、BL－220H分析天平 日本Shimadzu;Anke TDL－5低速離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠;HYQ－2121A型旋渦混勻器 蘇州捷美電子有限公司;Synergy－2型酶標(biāo)儀 美國Biotek公司;0101型打孔機 寧波得力集團公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 水提醇沉法制備粗多糖 取10g樣品粉末置于燒瓶內(nèi)，在90℃的熱水中，按照液料比20mL/g浸提6h，過濾后合并濾液，濃縮至原體積的1/5加入3倍體積的95%的乙醇純沉24h，以1000r/min的離心10min，分別以無水乙醇、丙酮沖洗2～3次，得到PFPD。

多糖得率(%)=鼎湖鱗傘多糖質(zhì)量/供試樣品質(zhì)量×100

1.2.2 PFPD提取的單因素實驗 提取溫度的影響:分別稱取5份1g鼎湖鱗傘菌絲體粉末，在浸提時間為 6h，液料比為 20mL/g，分別以 60、70、80、90、100℃五個溫度進行實驗，考察提取溫度對PFPD得率的影響。提取時間的影響:分別稱取5份1g鼎湖鱗傘菌絲體粉末，在浸提溫度為90℃，液料比20mL/g，以浸提時間為2、3、4、5、6h 五個時間梯度進行實驗，考察提取時間對PFPD得率的影響。提取液料比的影響:分別稱取5份1g鼎湖鱗傘菌絲體粉末，在浸提時間為6h，浸提溫度為 90℃，以液料比為 5、10、15、20、25mL/g五個梯度進行實驗，考察液料比對PFPD得率的影響。

1.2.3 鼎湖鱗傘多糖提取工藝正交實驗 選取浸提溫度(℃)、浸提時間(h)和液料比(mL/g)這三個因素進行三水平的正交實驗，因素水平表見表1。

表1 各因素水平設(shè)計Table 1 Design of every factor and level

1.2.4 動物分組及實驗設(shè)計 鼎湖鱗傘多糖體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)活性研究參照柯春林等［10－15］報道的方法作了一些修改。取同批次6周齡健康的雌性小白鼠，體重為(20±2)g進行適應(yīng)性飼養(yǎng)。飼養(yǎng)8d后，選擇體質(zhì)健壯、體重相近的小白鼠進行分組實驗。每組8只，共設(shè)置6組:第1組為正常對照組;第2組為模型對照組;第3組為陽性對照組;第4組為鼎湖鱗傘多糖低劑量組，標(biāo)記為PFPD－50;第5組為鼎湖鱗傘多糖中劑量組，標(biāo)記為PFPD－100;第6組為鼎湖鱗傘多糖高劑量組，標(biāo)記為 PFPD－200。正常對照組(Normal)每天腹腔注射一次生理鹽水0.5mL，共注射8d;環(huán)磷酰胺模型組(Cy－Model)每天腹腔注射一次生理鹽水 0.5mL，共注射 8d;實驗的第 2、3、4d，在每次注射完生理鹽水10h后，按劑量100mg/kg BW腹腔注射環(huán)磷酰胺一次;陽性對照組(Positive):每天腹腔注射一次鹽酸左旋米唑7mg/kg，共8d。鼎湖鱗傘多糖(PFPD)低劑量組每天一次腹腔注射多糖樣品劑量為50mg/kg BW;鼎湖鱗傘多糖(PFPD)中劑量組每天一次腹腔注射多糖樣品劑量為100mg/kg BW;鼎湖鱗傘多糖(PFPD)高劑量組每天注射劑量為200mg/kg BW的多糖樣品一次。實驗的第2、3、4d，在注射完多糖樣品10h后，按計量100mg/kg BW腹腔注射環(huán)磷酰胺一次。實驗連續(xù)進行8d，末次給藥12h后，將所有小鼠采用脫頸椎法全部處死，眼眶取血。解剖取出胸腺、脾臟，稱重并計算脾指數(shù)，胸腺指數(shù)，耳腫脹度，同時并測定血清溶血素及血清和脾臟中溶菌酶活性。小鼠飼養(yǎng)期間的環(huán)境溫度大約在24℃。實驗期間小鼠定量攝食(250g/kg BW左右)、自由飲水，鼠籠每天更換一次墊料。

1.2.5 鼎湖鱗傘多糖對免疫抑制小鼠器官的影響在末次給藥12h后，解剖小鼠取出脾臟、胸腺，用生理鹽水洗去血漬，濾紙吸干，稱重，計算臟器指數(shù)。

臟器指數(shù)(mg/g)=W1/W0

綜合以上分析，本文發(fā)現(xiàn)，中美英三方在實現(xiàn)不同的話語目的而采取了不同的趨近化語言策略，分別如圖1、圖2和圖3所示。

式中:W0為小鼠體重(g)，W1為臟器重量(mg)。

1.2.6 鼎湖鱗傘多糖樣品對小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響 注射給藥的第3d，給小鼠腹部剪去小塊毛發(fā)，面積約3cm×3cm，用1%二硝基氟苯(DNFB)50μL涂擦去毛部位。注射給藥的第7d，用1%二硝基氟苯20μL涂擦小鼠右耳兩側(cè)，左耳不擦作對照用。在末次給藥12h后，將小鼠脫頸椎處死后，用直徑為6mm的打孔器將左右耳片分別打孔，計算耳腫脹度。

耳腫脹度(%)=(W1－W0)/W0×100

式中:W0為左耳重量，W1為右耳重量。

1.2.7 鼎湖鱗傘多糖樣品對小鼠血清溶血素的影響(HC50) 在各組小鼠給藥的第4d，腹腔注射綿羊紅細(xì)胞0.2mL致敏。將制備好的血清稀釋至適宜倍數(shù)，各取0.2mL稀釋血清和2%的綿羊紅細(xì)胞0.1mL，再加入0.2mL配制好的豚鼠血清，混勻后放入37℃水浴30min。然后從每個樣品中吸取150μL加到酶標(biāo)板中，且每個樣品均做3個重復(fù)，用酶標(biāo)儀測540nm處的吸光度(OD540nm)值，記錄每個樣品的吸光度值，以O(shè)D值作為判定血清溶血素的指標(biāo)，比較各處理組小鼠的差異?？瞻讓φ?是用生理鹽水0.2mL代替血清樣品，其他操作同上。

1.2.8 鼎湖鱗傘多糖樣品對小鼠脾臟和血清中溶菌酶的影響 按上述方法，去脾臟，并且取出后將脾臟置于冰上，與生理鹽水按重量/體積比1∶9制備10%組織勻漿，5000r/min離心取上清液，放于－20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。斷頭處死小鼠后，解剖取出胸腺脾臟，同時稱重并計算臟器指數(shù)(mg/g BW)。用商業(yè)試劑盒測量(按其說明書操作)各組血清中溶菌酶(LZM)的含量。血清中LZM含量的測定是基于溶菌酶能夠水解細(xì)菌細(xì)胞壁上粘多糖而使細(xì)菌裂解、濃度降低、透光度增強的比濁法，表示為μg/mL。分組實驗連續(xù)飼養(yǎng)8d，最后一次用藥后便停食。24h后，稱重小鼠后斷頭處死，立即收集血液于小離心管中。血液樣品靜置1h，4000r/min離心10min制備小鼠血清。以上操作均在冰上進行，血清置－20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.9 統(tǒng)計分析 實驗結(jié)果數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，并應(yīng)用單因素方差分析和Duncan氏多重比較進行差異顯著性分析。p＜0.05被認(rèn)為差異是顯著的。所有數(shù)據(jù)的分析比較都運用SPSS18.0版本進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 鼎湖鱗傘粗多糖提取條件的單因素實驗

2.1.1 提取溫度對多糖得率的影響 由圖1可知，當(dāng)提取溫度在60～90℃范圍內(nèi)，隨著熱水浸提溫度的升高，多糖含量呈現(xiàn)逐漸增加趨勢，并且增加趨勢明顯。當(dāng)提取溫度為90～100℃時，多糖含量隨著溫度的升高，增加趨勢不明顯。由于浸提的溫度太高，多糖的結(jié)構(gòu)會發(fā)生變化，所以確定提取的溫度為90℃。

圖1 提取溫度對多糖得率的影響Fig.1 Effect of temperature on extraction rate of polysaccharides

2.1.2 提取時間對多糖得率的影響 從圖2中可以看出，在2～6h之間，隨著浸提時間的延長，多糖提取的含量逐漸增加。當(dāng)浸提的時間為6h時，提取的多糖含量最多，至6h后再延長提取時間，提取的多糖含量逐漸下降。因此，以提取的時間為6h為宜。

圖2 提取時間對多糖得率的影響Fig.2 Effect of time on extraction rate of polysaccharides

2.1.3 液料比對多糖得率的影響 由圖3可知，在液料比為5～20mL/g范圍內(nèi)，隨著液體比例的增加，提取的多糖含量隨之增加，但在20～25mL/g范圍內(nèi)，隨著液體比例的增加，提取的多糖含量有所減少，因此采用提取的液料比為20mL/g。

圖3 液料比對多糖得率的影響Fig.3 Effect of solvent－to－solid ratio on extraction rate of polysaccharides

2.2 鼎湖鱗傘多糖提取條件正交實驗

以影響鼎湖鱗傘多糖得率的提取溫度(℃)、提取時間(h)和液料比(mL/g)這三個因素進行L9(33)正交實驗，考察這三個因素的協(xié)同作用下多糖的得率。其結(jié)果如表2。

表2 正交實驗結(jié)果Table 2 The result of orthogonal experiment

由表2可知，對鼎湖鱗傘胞內(nèi)多糖得率的影響因素依次為RB＞RC＞RA，最優(yōu)化組合為 A2B3C2，即PFPD提取條件確定為液料比20mL/g、提取時間為6h、提取溫度90℃，此條件下多糖的得率為8.95%。通過水提醇沉法得到的粗多糖，主要成分為多糖類物質(zhì)還有蛋白質(zhì)及少量的小分子物質(zhì)［16］。

2.3 鼎湖鱗傘多糖對小鼠免疫器官臟器指數(shù)的調(diào)節(jié)作用

由于胸腺和脾臟是動物的重要免疫器官，因此胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的大小可以直接反映出機體免疫功能的強弱［17］。表3是鼎湖鱗傘多糖對小鼠免疫器官胸腺和脾臟的影響。

從表3中可以看出，PFPD－50為鼎湖鱗傘多糖低劑量組;PFPD－100為鼎湖鱗傘多糖中劑量組;PFPD－200為鼎湖鱗傘多糖高劑量組。模型組與正常對照組相比，脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著減少。鼎湖鱗傘多糖(PFPD)在50mg/kg的劑量時，脾臟指數(shù)的數(shù)據(jù)顯示不顯著，但在多糖的劑量為200mg/kg時，脾臟指數(shù)的數(shù)據(jù)顯示有顯著性差異。由此可知免疫抑制小鼠的脾臟指數(shù)隨著PFPD濃度的增大而增大，甚至比正常小鼠的脾臟指數(shù)還大。以此說明鼎湖鱗傘多糖能使因環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)產(chǎn)生的脾臟指數(shù)下降得以恢復(fù)，在一定程度上起到了提高機體免疫的能力。但與環(huán)磷酰胺模型組相比，三種不同劑量的鼎湖鱗傘多糖均對環(huán)磷酰胺引起的小鼠胸腺指數(shù)下降無拮抗作用。

表3 PFPD對小鼠脾臟和胸腺指數(shù)的影響Table 3 Effect of PFPD on the index of spleen and thymus

2.4 鼎湖鱗傘多糖對遲發(fā)型超敏反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用［18］及對血清中溶血素(HC50)的影響［19－20］

鼎湖鱗傘多糖對小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)耳腫脹度的影響見表4中。

從表4中可以看出:環(huán)磷酰胺模型組和正常對照組相比，耳腫脹度顯著性減少(p＜0.05)。說明環(huán)磷酰胺免疫抑制模型建模成功。而陽性藥物組和不同劑量的鼎湖鱗傘多糖組處理，均顯著地提高DTH的耳腫脹度(p＜0.05)，且這種變化與鼎湖鱗傘多糖呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系。

鼎湖鱗傘多糖對小鼠血清中溶血素(HC50)的影響見表4所示:小鼠連續(xù)三天注射100mg/mL環(huán)磷酰胺后，其HC50值顯著降低(p＜0.05)。說明環(huán)磷酰胺免疫抑制模型建模成功。陽性藥物鹽酸左旋咪唑組與環(huán)磷酰胺免疫抑制模型相比，可以顯著地提高免疫小鼠體內(nèi)溶血素水平(p＜0.05)。當(dāng)PFPD濃度達到100mg/mL時，可以使小鼠血清中的溶血素水平提高，當(dāng)PFPD濃度為200mg/mL時，小鼠血清中溶血素水平大于正常小鼠水平。實驗結(jié)果表明:PFPD能有效提高免疫力低下小鼠的體內(nèi)免疫功能。

表4 PFPD對小鼠耳腫脹度和血清溶血素的影響Table 4 Effect of PFPD on swelling rate of ear

2.5 鼎湖鱗傘粗多糖對小鼠血清中溶菌酶活性的調(diào)節(jié)作用

從圖4中可以看出，環(huán)磷酰胺模型組與正常對照組相比，小鼠血清中的溶菌酶含量顯著降低(p＜0.05)，表明環(huán)磷酰胺免疫抑制模型建模成功。三種不同劑量的鼎湖鱗傘粗多糖組與正常對照組和模型組相比，其血清中的溶菌酶含量極顯著上升，且這種變化與劑量呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。

圖4 PFPD對小鼠血清中溶菌酶活性的影響(U/mL)Fig.4 Effect of PFPD on activity of lysozyme in mice serum(U/mL)

2.6 鼎湖鱗傘粗多糖對小鼠脾臟中溶菌酶活性的調(diào)節(jié)作用

從圖5可知:與正常對照組相比，環(huán)磷酰胺模型組脾臟中溶菌酶含量顯著降低(p＜0.05)，表明環(huán)磷酰胺免疫抑制模型建模成功。小鼠腹腔注射不同劑量的鼎湖鱗傘多糖后，與正常對照組和模型組的小鼠相比，其脾臟中的溶菌酶含量極顯著上升，且這種變化與劑量組呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。

圖5 PFPD對小鼠脾臟中溶菌酶活性的影響Fig.5 Effect of PFPD on activity of lysozyme in mice spleen(U/mL)

3 結(jié)論

本實驗表明:PFPD最佳的提取工藝條件為:提取溫度為90℃，提取時間為6h，液料比為20mL/g，PFPD的得率為8.95%。腹腔注射環(huán)磷酰胺后，免疫抑制鼠免疫功能和正常對照組相比有所下降，但用不同劑量的PFPD處理后免疫抑制鼠的免疫能力有所提高。環(huán)磷酰胺模型組與正常對照組相比，脾臟和血清中溶菌酶含量顯著降低(p＜0.05)，表明環(huán)磷酰胺免疫抑制模型建模成功。小鼠腹腔注射不同劑量的鼎湖鱗傘多糖后，與正常對照組和模型組的小鼠相比，其脾臟和血清中的溶菌酶含量均極顯著上升，且這種變化與劑量組呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。本實驗表明，PFPD具有明顯的免疫調(diào)節(jié)活性，能提高免疫抑制鼠的非特異性免疫反應(yīng)。由此得出鼎湖鱗傘粗多糖具有一定的體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)活性，是一種良好的免疫調(diào)節(jié)劑。

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