酶法制備白鰱魚蛋白粉的研究

王 麗，姜啟興，許艷順，夏文水

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122)

淡水魚的加工可開發(fā)魚糜制品、魚腸、魚圓和魚干以及魚罐頭等產(chǎn)品，這些產(chǎn)品已有工業(yè)化生產(chǎn)并在市場銷售。另一類主要產(chǎn)品是魚蛋白粉。魚蛋白粉是用魚肉通過消化、過濾、濃縮、噴霧干燥而得到的一種淺黃色至類白色的粉末，具有含水量低、利于貯藏的特點(diǎn)，可進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。目前，魚蛋白粉的生產(chǎn)主要還是集中在飼用魚粉方面，產(chǎn)品質(zhì)量不高。已有學(xué)者在開發(fā)食用魚蛋白粉，采用的技術(shù)主要是酶解技術(shù)［1－2］。Ting［1］等以龍頭魚為原料，通過酶解、冷凍干燥等工藝，開發(fā)出一種魚蛋白粉產(chǎn)品。Ting［2］等制備了凍干帶魚蛋白粉并對其營養(yǎng)進(jìn)行評價(jià)，表明帶魚蛋白粉蛋白質(zhì)含量豐富，必需氨基酸含量高，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值，可以作為蛋白質(zhì)強(qiáng)化劑應(yīng)用于食品工業(yè)中。但魚蛋白粉產(chǎn)品還存在溶解性不好、分散性差等問題，需要進(jìn)一步研究溶解性好、分散性好的魚蛋白粉，以擴(kuò)大魚蛋白粉的應(yīng)用范圍。魚蛋白溶液的干制通常有真空干燥法，但生產(chǎn)效率不高。噴霧干燥法是一種自動化程度高可連續(xù)大規(guī)模生產(chǎn)的干燥方法，生產(chǎn)的蛋白粉受熱時(shí)間短、復(fù)水性好，質(zhì)量高。魚蛋白溶液濃度的高低和噴霧干燥條件對于干燥節(jié)能和蛋白粉質(zhì)量有密切的關(guān)系。本文旨在通過研究木瓜蛋白酶水解條件對魚蛋白水解度的影響以及噴霧干燥條件對蛋白粉物性和水溶性的影響，確定木瓜蛋白酶水解白鰱魚蛋白的最適條件以及噴霧干燥的合理?xiàng)l件，最后對制得的魚蛋白粉的營養(yǎng)品質(zhì)進(jìn)行分析，為食用魚蛋白粉的開發(fā)應(yīng)用提供指導(dǎo)與參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮活白鰱魚(2～3kg) 購于無錫市濱湖區(qū)雪浪鎮(zhèn)農(nóng)貿(mào)市場;木瓜蛋白酶(酶活80萬U/g) 廣西南寧龐博生物科技有限公司;氫氧化鈉、鹽酸等其他試劑:分析純 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

DK－8AXX型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;AB104－N型電子天平 上海第二天平儀器廠;EL3002型電子天平、pH計(jì) 梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司;XBLL－25型多功能食品加工機(jī) 上海帥佳電子科技有限公司;TDL－5－A型離心機(jī) 上海安亭鎮(zhèn)飛鴿牌離心機(jī);XMTFCH－6000型消化爐 上海儀器檢測有限公司;Qz－4型噴霧干燥設(shè)備 錫山林州干燥廠;Waters 600型高效液相色譜儀 美國waters公司;Agilent 1100型高效液相色譜儀 美國Agilent Techologies。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 魚處理 將購得的鮮活白鰱魚，經(jīng)宰殺、去鱗、去內(nèi)臟、去頭、去尾、剝皮，清洗干凈后采肉，經(jīng)初步破碎再用絞肉機(jī)絞碎成均勻糜狀。

1.2.2 魚肉酶水解 稱取500g魚糜置于酶解罐中，加入一定量的蒸餾水，設(shè)定溫度，調(diào)整pH，加入一定量的木瓜蛋白酶，水解一定時(shí)間;100℃滅酶15min，冷卻至室溫。

1.2.3 水解條件的確定 酶解過程中的酶解溫度、pH、加酶量、酶解時(shí)間和底物濃度都會影響酶解的效率，主要以水解度為指標(biāo)對酶解條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.4 水解度測定 水解度(Degree of Hydrolysis，DH)測定參照 Aider－Nissen 等［3］，在中性及酸性條件下采用pH－stat法。水解度的計(jì)算公式:

式中:Vb:消耗的氫氧化鈉溶液的體積，mL;Nb:氫氧化鈉溶液的摩爾濃度，mol/L;α:氨基解離度(根據(jù)具體情況而定);Mp:底物中蛋白質(zhì)的質(zhì)量，g;Htot:底物蛋白質(zhì)中的肽鍵總數(shù)，mmol/g，對于魚肉，Htot=8.4mmol/g。

1.2.5 黏度的測定 使用Brookfield DV－Ⅱ+Pro型黏度儀在25、60℃恒溫水浴條件下測定酶解液的體系黏度，使用SC4－18轉(zhuǎn)子測量。

1.2.6 蛋白粉溶解度的測定 溶解度測定法［4］。

1.2.7 干燥條件的確定 根據(jù)盡可能降低能耗的原則，在不同的蛋白質(zhì)水解液固形物含量與干燥進(jìn)風(fēng)溫度和進(jìn)料速度下得到魚蛋白粉，測定該魚蛋白粉的水分含量、白度、堆積密度、分散性和流動性等理化指標(biāo)，從而確定魚蛋白粉噴霧干燥的合適條件。

1.2.8 基本成分測定 水分含量:105℃恒重法［5］;粗蛋白質(zhì)含量:凱氏定氮法［6］。

1.2.9 堆積密度的測定 將魚蛋白粉從漏斗中撒落至10mL量筒中，測定10mL魚蛋白粉的質(zhì)量，換算出其堆積密度(g/mL)。

1.2.10 白度的測定 采用UltraScan Pro高精度分光測色儀測定粉末樣品的L*、a*、b*值。按照下式計(jì)算產(chǎn)品的白度W:

W=100－［(100－L*)2+a*2+b*2］0.5

式中:L*值表示樣品的亮度，值越大表示樣品亮度越高;a*值表示樣品的紅綠值，+a*表示樣品偏紅，－a*表示樣品偏綠;b*值表示樣品的藍(lán)黃值，+b*表示樣品偏黃，－b*表示樣品偏藍(lán)。

1.2.11 潤濕性的測定 在250mL燒杯中加入200mL去離子水，稱取0.5g樣品均勻撒布于水面上，在靜置條件下，測定魚蛋白粉從加入到潤濕所需要的時(shí)間(s)。

1.2.12 分散性的測定 在100mL燒杯中加入50mL去離子水，加入5g魚蛋白粉，在恒溫磁力攪拌器上以一定的轉(zhuǎn)速攪拌，記錄從攪拌開始至粉全部分散所需的時(shí)間(s)，分散時(shí)間越少，分散性越好。

1.2.13 流動性的測定 將漏斗固定于水平放置的坐標(biāo)紙上高度H處，將魚蛋白粉沿漏斗壁倒入下方坐標(biāo)紙上形成的粉圓錐體尖端接觸到漏斗口為止，測定坐標(biāo)紙上圓錐體底部的半徑(R)，計(jì)算休止角α=arctg(H/R)，式中:H:漏斗口與坐標(biāo)紙的垂直距離(mm);R:粉圓錐體底部的半徑(mm);α:休止角，粉圓錐體沿底面直徑縱切后所得三角形的底角(°)。休止角越小表明流動性越好。

1.2.14 均質(zhì)魚蛋白粉的制備 稱取500g魚糜，加入1000mL的蒸餾水，均質(zhì)3遍后進(jìn)行噴霧干燥，噴霧干燥條件同酶法制備魚蛋白粉。

1.2.15 氨基酸組成分析 參照胡方園等［7］，采用OPA－FMOC柱前衍生化法對酶解產(chǎn)物氨基酸組成進(jìn)行分析。

1.2.16 蛋白分子量分布的測定 參照胡方園等［7］，采用HPSEC凝膠過濾色譜法對酶解產(chǎn)物的分子量分布進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶解條件的優(yōu)化

2.1.1 加酶量對蛋白水解度的影響在木瓜蛋白酶的不同添加量下，對魚肉水解的影響見圖1。從圖中可以看出，蛋白水解度隨著酶添加量的增大呈現(xiàn)出先增大后穩(wěn)定的趨勢。當(dāng)加酶量為4000U/g蛋白質(zhì)時(shí)，水解度已達(dá)到23.29%，酶濃度達(dá)到飽和;即使加酶量加大到7000U/g蛋白質(zhì)，水解度為23.80%，沒有明顯增加。這可能是因?yàn)椋磻?yīng)剛開始時(shí)酶促反應(yīng)體系處于底物過量的狀態(tài)，所以水解度會隨著酶添加量的增大而增大;而隨著酶濃度的不斷增加，直到飽和，此時(shí)酶與底物已經(jīng)完全結(jié)合，再增加酶也不能與底物結(jié)合，故酶濃度的增大對反應(yīng)速度幾乎沒有影響，所以選定酶添加量為4000U/g蛋白質(zhì)。

圖1 木瓜蛋白酶在不同加酶量時(shí)的水解度Fig.1 The degree of hydrolysis with Papain at different enzyme dosages

2.1.2 酶解溫度對蛋白水解度的影響 酶的最適溫度會隨著體系的改變而有所差異，對不同溫度下木瓜蛋白酶對魚肉蛋白水解度的影響所得到的結(jié)果如圖2所示。從圖中可以看出，當(dāng)溫度低于50℃時(shí)，蛋白水解度隨著溫度的升高而增大，溫度大于50℃以后，隨著溫度的上升，水解度呈下降趨勢。這可能是由于溫度低于50℃時(shí)，溫度對酶促反應(yīng)的影響更大，蛋白水解度隨著溫度的升高而增大;但當(dāng)溫度超過50℃后，酶受熱變性的因素占優(yōu)勢，最終使酶促反應(yīng)速度下降。在50℃時(shí)，蛋白的水解度達(dá)到最大值，所以選定50℃為木瓜蛋白酶酶解白鰱魚蛋白的最適溫度。

圖2 木瓜蛋白酶在不同溫度時(shí)的水解度Fig.2 The degree of hydrolysis with different temperatures

2.1.3 pH對蛋白水解度的影響在不同pH下木瓜蛋白酶對魚肉蛋白水解度的影響結(jié)果見如圖3所示。從圖中可以看出，pH＜6.5時(shí)，水解度與pH呈正相關(guān);當(dāng)pH＞6.5時(shí)，水解度逐漸下降;因此，確定木瓜蛋白酶水解魚肉的最適pH為6.5。

圖3 木瓜蛋白酶在不同pH時(shí)的水解度Fig.3 The degree of hydrolysis with different pH

2.1.4 酶解時(shí)間對產(chǎn)物分子量分布的影響 在不同酶解時(shí)間(1、2、3、4、5、6、7h)下，水解產(chǎn)物經(jīng)過噴霧干燥后的蛋白粉測定其分子量分布結(jié)果如圖4所示。從圖中可以看出，酶解1h得到的產(chǎn)物分子量＞1000的組分含量為14.22%，酶解2h的為13.72%，酶解3h的為11.21%，當(dāng)酶解4h時(shí)，分子量＞1000的組分含量降低到9.10%，不同酶解時(shí)間得到的粉分子量差異顯著。但是當(dāng)酶解4h時(shí)，分子量＜180的組分含量也從1h時(shí)的9.91%增大到了11.43%，再延長酶解時(shí)間，分子量＜1000的組分含量變化非常緩慢，因此，酶解時(shí)間定為4h。

圖4 不同酶解時(shí)間酶解產(chǎn)物分子量分布Fig.4 Molecular weight distribution of protein hydrolyzed by Papain with different time

2.1.5 底物濃度對蛋白水解度的影響 不同底物濃度對木瓜蛋白酶水解魚肉的效果影響結(jié)果如圖5所示。從圖中可以看出，隨著底物濃度的增大，木瓜蛋白酶對鰱魚蛋白的水解度有一定的增大，但是當(dāng)?shù)孜餄舛雀哂?.5%以后，水解度出現(xiàn)明顯下降。這可能是因?yàn)樵谝欢ǖ拿笣舛认?，?dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)，反應(yīng)速度與底物濃度的關(guān)系呈正相關(guān);然而隨著底物濃度的不斷增加，酶的結(jié)合位點(diǎn)達(dá)到飽和，底物濃度再增加對反應(yīng)速度已經(jīng)幾乎沒有影響，但是底物濃度的增大同時(shí)會增加酶與蛋白特殊位點(diǎn)結(jié)合的空間位阻，從而導(dǎo)致酶促反應(yīng)速度反而下降?？梢缘贸觯?dāng)?shù)孜餄舛葹?.5%時(shí)，木瓜蛋白酶對鰱魚蛋白的酶解效果最好。

圖5 木瓜蛋白酶在不同底物濃度時(shí)的水解度Fig.5 The degree of hydrolysis with different substance concentrations

2.2 噴霧干燥條件的優(yōu)化

2.2.1 白鰱酶解液固形物含量對黏度的影響 對不同固形物含量下酶解液的黏度變化曲線見圖6。從圖中可以看出，酶解液的黏度隨著固形物含量的增加而增加。在酶解液固形物含量較低時(shí)，酶解液的黏度變化緩慢，當(dāng)酶解液固形物含量達(dá)到25%后，酶解液黏度急劇增大。當(dāng)固形物含量達(dá)到30%以后，酶解液的黏度達(dá)到3000mPa·s以上，高黏度通常在生產(chǎn)中會導(dǎo)致液體難以霧化。因此，將料液濃縮到25%～30%后進(jìn)行噴霧干燥比較為宜。

圖6 白鰱魚酶解液黏度隨固形物含量的變化Fig.6 Changes of viscosity with the solids content

2.2.2 進(jìn)料濃度的確定 將酶解液濃縮后噴霧干燥，不同濃度的酶解產(chǎn)物噴霧干燥后的蛋白粉品質(zhì)見表1。從表中可以看出，隨著進(jìn)料濃度的增加，產(chǎn)品水分含量逐漸下降，白度逐漸下降，堆積密度逐漸增大，流動性變好，分散性也越來越好。當(dāng)進(jìn)料濃度＞20%時(shí)，魚蛋白粉水分含量＜5%，而且魚蛋白粉的流動性得到改善，堆積密度增加。流動性的提高可能是因?yàn)楦邼舛任锪嫌欣谛纬纱罅降母稍镱w粒［8－9］。堆積密度增大可能是由于進(jìn)料濃度增大導(dǎo)致顆粒粒徑增大以及粒子間距離減小所產(chǎn)生的綜合效應(yīng)。產(chǎn)品白度稍有下降，可能由外部過度干燥而引起［10］。

表1 進(jìn)料濃度對魚蛋白粉各項(xiàng)指標(biāo)的影響Table 1 The effect of different solids content on the various indicators of hydrolyzed protein powder from silver carp

2.2.3 進(jìn)風(fēng)溫度的確定 進(jìn)風(fēng)溫度對魚蛋白粉品質(zhì)的影響見表2。由表中可知，隨著進(jìn)風(fēng)溫度由160℃升高到200℃，粉的白度由92.33下降到85.67，粉的分散性逐漸由不可測改善到59s，流動性由59.8s下降到26.6s，潤濕性由61s下降到26s，但溫度變化對堆積密度的影響不明顯。在相同進(jìn)風(fēng)量條件下，干燥室的溫度越高，物料進(jìn)入降速干燥階段時(shí)間就越早，對應(yīng)的干燥產(chǎn)品的含水量就越低，但是當(dāng)進(jìn)風(fēng)溫度高于190℃時(shí)，影響蛋白粉品質(zhì)。當(dāng)進(jìn)風(fēng)溫度低于170℃時(shí)，魚蛋白粉的水分含量高于5%。因此，噴霧干燥進(jìn)風(fēng)溫度控制在170～180℃為佳。

表2 進(jìn)風(fēng)溫度對魚蛋白粉各項(xiàng)指標(biāo)的影響Table 2 The effect of inlet air temperature on the various indicators of hydrolyzed protein powder from silver carp

2.2.4 進(jìn)料速度的確定 進(jìn)料速度對魚蛋白粉品質(zhì)的影響見表3。由表中可知，隨著進(jìn)料速度由6mL/min增加到14mL/min，產(chǎn)品的水分含量由3.06%升高到5.23%，堆積密度由0.235g/mL增加到0.313g/mL，休止角變從54.8°下降到41.2°，說明產(chǎn)品流動性變好，但是對白度的影響不明顯。這是由于進(jìn)料速度直接影響出風(fēng)溫度。進(jìn)料速度越大出風(fēng)溫度越低，而過低的出風(fēng)溫度(過高的進(jìn)料速度)將導(dǎo)致終產(chǎn)品水分含量高，分散性差，結(jié)團(tuán)嚴(yán)重。但是出風(fēng)溫度過高(進(jìn)料速度過低)會使蛋白粉容易焦糊。綜合考慮，進(jìn)料速度控制在10～12mL/min較適宜。

表3 進(jìn)料速度對魚蛋白粉各項(xiàng)指標(biāo)的影響Table 3 The effect of feed velocity on the various indicators of hydrolyzed protein powder from silver carp

2.3 酶法制備魚蛋白粉與均質(zhì)魚蛋白粉的品質(zhì)比較

將酶法制備魚蛋白粉與均質(zhì)魚蛋白粉的品質(zhì)進(jìn)行比較，結(jié)果見表4。由表中可以看出，酶法制備魚蛋白粉的品質(zhì)明顯優(yōu)于均質(zhì)魚蛋白粉。酶法制備魚蛋白粉的溶解度達(dá)到98.52%，明顯高于均質(zhì)魚蛋白粉的37.23%。酶法制備魚蛋白粉的分散性和潤濕性有了很大的提高，分散性從無法分散提高到70s，潤濕性從262s提高到40s。

表4 酶法制備魚蛋白粉與均質(zhì)魚蛋白粉的品質(zhì)比較Table 4 The difference of hydrolyzed protein powder and protein powder

2.4 魚蛋白粉氨基酸組成

酶法制備魚蛋白粉與均質(zhì)魚蛋白粉的氨基酸組成見表5。由表中可知，酶法制備魚蛋白粉的氨基酸組成優(yōu)于均質(zhì)魚蛋白粉。酶法制備魚蛋白粉的必需氨基酸含量達(dá)到40%以上，超過 FAO/WHO/UNU(2007)推薦值，可以作為很好的蛋白質(zhì)配料。魚蛋白粉中賴氨酸含量較高，適合添加在我國大部分人口的谷物食物中以補(bǔ)充賴氨酸，同時(shí)還可以提高食物蛋白質(zhì)的吸收和利用，達(dá)到均衡營養(yǎng)，促進(jìn)生長發(fā)育的目的。此外，魚蛋白粉中組氨酸含量較高，可以考慮將其添加在嬰幼兒食品中。

表5 兩種魚蛋白粉的氨基酸組成比較(g/100g蛋白質(zhì))Table 5 The comparison of amino acid composition of hydrolyzed protein powder and protein powder(g/100g protein)

3 結(jié)論

3.1 白鰱魚采肉后經(jīng)打漿被木瓜蛋白酶酶解，在溫度50℃、加酶量4000U/g蛋白質(zhì)、底物濃度為5.5%、pH6.5、時(shí)間4h的工藝條件下魚蛋白質(zhì)的水解度達(dá)到29.82%，其中相對分子量1000以下的組分占90.90%。

3.2 白鰱魚蛋白酶水解液經(jīng)濃縮至25%～30%后，采用噴霧干燥控制進(jìn)風(fēng)溫度170～180℃、出風(fēng)溫度80～90℃，所制備的魚蛋白粉產(chǎn)品呈乳白色，流動性好、易潤濕，溶解度達(dá)98.52%。

3.3 酶法制備的鰱魚蛋白粉魚蛋白粉必需氨基酸含量達(dá)到40%以上，賴氨酸含量較高，是一種營養(yǎng)價(jià)值高的優(yōu)質(zhì)蛋白，可作為蛋白質(zhì)功能性食品配料。

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