原核生物16S rRNA基因多重拷貝及其序列異化

閻永偉，張德民

(寧波大學(xué)應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波315211)

核糖體RNA(rRNA)分子存在于所有細(xì)胞生物中，在細(xì)胞中執(zhí)行恒定的功能，其分子序列既有高度保守性片段，又有相對(duì)可變性部分，其本身的進(jìn)化就反映了生物系統(tǒng)發(fā)育歷史，因此可以用來(lái)重現(xiàn)所有細(xì)胞生物間的進(jìn)化關(guān)系［1］。Carl Wose在對(duì)100多種細(xì)胞生物的小亞基RNA分子序列比較分析的基礎(chǔ)上提出了生物三域說(shuō)，使核糖體小亞基rRNA基因(Small subunit ribosomal rRNA gene，rrs)成了原核生物系統(tǒng)及分類(lèi)學(xué)研究的核心標(biāo)識(shí)基因，在原核生物分類(lèi)、鑒定與系統(tǒng)發(fā)生［1-4］以及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性分析［5-7］、細(xì)菌定量等方面得到廣泛應(yīng)用。隨著對(duì)rrs研究的深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌基因組內(nèi)的rrs是多重拷貝的，有些物種中rrs各拷貝間還存在差異［8］，這種差異有時(shí)會(huì)大于不同菌株間甚至不同種間的差異。研究表明，細(xì)菌基因組內(nèi)rrs拷貝數(shù)(Copy number of rrs，CN-rrs)和異化與其利用環(huán)境資源的生態(tài)策略和對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性有關(guān)。

1 原核生物基因組內(nèi)的CN-rrs是原核生物種的基本特征之一

截至2012年10月31日，有1297個(gè)細(xì)菌菌株和89個(gè)古菌菌株的CN-rrs被測(cè)定，數(shù)量從1個(gè)到15個(gè)不等［8-9］，不同拷貝數(shù)的菌株所占比例見(jiàn)圖1，1～2個(gè)拷貝rrs的菌株最多，各占20%;3～7個(gè)rrs拷貝數(shù)的菌株數(shù)也比較多，各占10%左右;8個(gè)拷貝以上的菌株相對(duì)較少。在屬以上分類(lèi)階元上CN-rrs與其發(fā)育學(xué)地位沒(méi)有關(guān)系。但在屬的水平上，CN-rrs相對(duì)穩(wěn)定，如Borrelia屬8個(gè)種23個(gè)菌株都是1個(gè)，Escherichia屬的2個(gè)種21個(gè)菌株全部是7個(gè);但也有一些屬的CN-rrs有一定變化，有些屬中變化還比較大，如Bacillus屬7～14個(gè)拷貝，Clostridium屬則從4個(gè)(如C.thermocellum)到15個(gè)(如C.paradoxum)不等。在種的水平上，絕大多數(shù)細(xì)菌的CN-rrs都一致，但也有個(gè)別種有變化，如Rhodopseudomonas palustris為 1～2個(gè)，B.cereus中 12～14個(gè)，而C.botulinum中變化最大，含有8、9和11個(gè)rrs的菌株都有發(fā)現(xiàn)。當(dāng)然，目前絕大多數(shù)種只測(cè)了1個(gè)菌株的CN-rrs，相信隨著每個(gè)種所測(cè)菌株數(shù)的增多，CN-rrs稍有波動(dòng)的種的比例會(huì)有所增加，但不會(huì)太多，因?yàn)榍懊嫠?，有些屬的CN-rrs就是一個(gè)恒定值。所以，可以說(shuō)，CN-rrs是原核生物種的基本特征之一。

圖1 具有不同拷貝數(shù)16S rRNA基因的原核生物比例分布圖(數(shù)據(jù)來(lái)源于rrndb數(shù)據(jù)庫(kù)［9］)Fig 1 Distribution of frequency of prokaryotes with different copy number of 16S rRNA gene(Data retrived from rrndb database［9］)

2 原核生物CN-rrs與其利用環(huán)境資源的生態(tài)策略有關(guān)

rRNA是調(diào)節(jié)核糖體合成的關(guān)鍵因子之一，而核糖體在細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖等基本生命活動(dòng)中占據(jù)核心地位，因此，一般認(rèn)為，細(xì)胞內(nèi)CN-rrs越多，其合成rRNA越多，進(jìn)而促進(jìn)了核糖體的合成，因而有利于細(xì)菌達(dá)到較高的生長(zhǎng)速度。Stevenson和Schmidt［10］在敲除E.coli的不同rRNA操縱子后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)停滯期延長(zhǎng)，生長(zhǎng)速率降低，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)能力下降，整體適應(yīng)能力也隨之降低。但是，另有實(shí)驗(yàn)表明，即使在富集培養(yǎng)基上快速生長(zhǎng)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)rrs合成rRNA的潛力也沒(méi)有充分表現(xiàn)出來(lái)，因?yàn)镋.coli中的7個(gè)rrs有4個(gè)失活后，其他rrs的表達(dá)活性明顯提高［11］。進(jìn)一步工作表明，5個(gè)rrs的表達(dá)就足夠支持E.coli在復(fù)合培養(yǎng)基上的快速生長(zhǎng)，但是當(dāng)E.coli由脅迫條件轉(zhuǎn)入適宜條件時(shí)，如由合成培養(yǎng)基到復(fù)合培養(yǎng)基，或從28℃轉(zhuǎn)入42℃，7個(gè)rrs對(duì)于其快速達(dá)到新的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期都有作用，每失活1 個(gè) rrs都伴隨著響應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)［12，13］，說(shuō)明多拷貝rrs是其適應(yīng)進(jìn)化的結(jié)果，賦予細(xì)菌面臨可利用環(huán)境資源發(fā)生有利變化時(shí)的選擇性優(yōu)勢(shì)［14］。但是，這種優(yōu)勢(shì)又帶來(lái)不利的一面，就是當(dāng)其處于恒定的、緩慢生長(zhǎng)條件下，多拷貝的結(jié)構(gòu)性表達(dá)產(chǎn)生過(guò)量的rRNA和核糖體，成為其代謝負(fù)擔(dān)，反而引起生長(zhǎng)速度的降低，且生長(zhǎng)速度越慢，其影響越大［13，15］。

Klappenbach 等［16］提出，CN-rrs代表了細(xì)菌各發(fā)育譜系利用資源的生態(tài)策略，高CN-rrs菌對(duì)資源的輸入快速響應(yīng)［17］，而低CN-rrs菌則在持續(xù)的緩慢生長(zhǎng)時(shí)有效分配資源。因此，當(dāng)土壤細(xì)菌暴露于復(fù)合營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上時(shí)，能在1～2 d內(nèi)快速形成菌落的細(xì)菌，具有的CN-rrs平均5.5個(gè)，而延遲到5 d后形成菌落的細(xì)菌，其 CN-rrs只有1.4 個(gè)［16］。Shrestha等［18］在研究土壤微生物群落演替時(shí)發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌的生長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間和rrs拷貝數(shù)與群落演替階段顯著相關(guān)，早期細(xì)菌多數(shù)都在1 d，個(gè)別在2 d內(nèi)形成肉眼可見(jiàn)菌落，且多數(shù)菌株的CN-rrs大于4，而后期細(xì)菌則大多在3～15 d內(nèi)形成可見(jiàn)菌落，且CN-rrs小于2。另外，具有rrs拷貝較少的細(xì)菌通常是寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌，生長(zhǎng)在低營(yíng)養(yǎng)的環(huán)境中［19，20］。

3 原核生物基因組內(nèi)rrs拷貝間的異化

因菌株而異，細(xì)菌基因組內(nèi)rrs各拷貝序列間既可以完全相同［8］，又可以完全不同，也可以有幾個(gè)相同，又與另外幾個(gè)不同［9］。如Streptococcus agalactiae 2603 V/R具有7個(gè)完全相同的 rrs，而 B.subtilis的菌株168，10個(gè)rrs序列各不相同［8］。rrs拷貝數(shù)較低的菌株中，序列相同的比例很高，如帶有2個(gè)或3個(gè)rrs的菌株，序列完全相同的菌株超過(guò)70%，而8個(gè)拷貝以上的菌株都存在rrs序列的異化。通常，基因組內(nèi)rrs序列間差異小于1%，但有時(shí)也會(huì)大于1%，其差異超過(guò)種內(nèi)不同菌株，甚至不同種間的差異［21-23］。例如，V.splendidus菌株 PB1-10的13個(gè) rrs拷貝分別與 V.splendidus，V.lentus，V.aestuarianus，V.tasmaniensis和 V.anguillarum等五個(gè)種聚在一起［22］;V.alginolyti-cus ATCC 17749T的 2個(gè) rrs序列(X74690，X56576)之間的相似性只有98.8%，但序列X74690與V.harveyi CECT 525T(X74706)、V.parahaemolyticus CECT 511T(X74720)、V.campbellii 523T(X74692)、V.natriegens CECT526T(X74714)和 V.rotiferianus CECT 577T(AJ316187)等種的模式株的相似性均高于98.8%，同時(shí)，序列 X56576與 V.campbellii 523T的另一條序列(X56575)相似性也高于98.8%。我們通過(guò)PCR產(chǎn)物直接測(cè)序得到的該模式株的序列(JN188438)與X56576和 X74690的序列均不同，相似度分別是98.5%與99.4%，而與V.parahaemolyticus CECT 511T(X74720)、V.campbellii 523T(X74692)、V.natriegens CECT526T(X74714)和 V.rotiferianus CECT 577T(AJ316187)等種模式株的相似性均高于99.5%［23］。在極端情況下，基因組rrs間的差異超過(guò)10%，甚至20%，如 Thermoanaerobacter tengcongensis的4個(gè)rrs間的最大差異可達(dá)到11.6%，Borrelia afzelii的兩個(gè)rrs拷貝的差異為 20.38%［8］。

4 原核生物基因組內(nèi)rrs拷貝間異化與其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)有關(guān)

Nilsson等［24］報(bào)道，V.vulnificus的 rrs可分成 A、B兩種類(lèi)型。B類(lèi)型與臨床菌株相關(guān)，而A與環(huán)境菌株相關(guān)。另外，Lin和Schwarz［25］發(fā)現(xiàn)A型菌株多分離于六七月份，而B(niǎo)型菌株多分離于9月份。已有一些證據(jù)將rrs序列的異化與細(xì)菌的生長(zhǎng)溫度聯(lián)系起來(lái)。芽孢桿菌屬的B.cereus群包括兩個(gè)中溫菌(B.cereus和B.thuringiensis)及兩個(gè)低溫菌(B.mycoides和 B.weihenstephanensis)。Pruss等［26］發(fā)現(xiàn)，中溫菌和低溫菌都有其特有的rrs印跡，在22個(gè)核苷酸長(zhǎng)的片段上(180bp to 201bp，按B.cereus的16S rDNA計(jì)算)，有3個(gè)堿基在中溫菌是G或C，而在低溫菌則是A或T。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，有些菌株2種印跡都包含，且適宜溫度也介于中溫菌和低溫菌之間。實(shí)際上，B.cereus群的CN-rrs在6～10個(gè)之間，低溫印跡和高溫印跡在不同拷貝的rrs上。Guinebretiere等［27］依據(jù)AFLP指紋技術(shù)將425株B.cereus群分成7個(gè)組，其生長(zhǎng)溫度的上下限也相應(yīng)地呈梯度分布，且在用rrs序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上也聚成相應(yīng)的7個(gè)發(fā)育分支。嗜鹽古菌Haloarcula marismortui具有3個(gè)rrs，其中2個(gè)拷貝(A和C)基本上是相同的，但另一個(gè)(B)的核苷酸序列則有較大的差異。研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)溫度對(duì)rrs的表達(dá)產(chǎn)生了顯著影響，基因B在50℃的表達(dá)量比另外一組的高4倍，而15℃時(shí)，其表達(dá)量則比后者低3倍。一個(gè)缺乏B基因的突變體在高溫下生長(zhǎng)速度較慢。但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)鹽濃度對(duì)其表達(dá)量有影響［28］。Lauro等［29］的研究表明，Photobacterium profundum SS9的 rrs的2個(gè)螺旋臂的延伸與其嗜壓生理特性有關(guān)。這些現(xiàn)象支持的觀點(diǎn)是:差異的rRNA基因是對(duì)環(huán)境適應(yīng)的需要，不同的基因在不同的條件下執(zhí)行同樣的功能。

5 展望

除了與其對(duì)環(huán)境資源利用策略有關(guān)外，原核生物的rrs拷貝數(shù)及其異化還和其細(xì)胞分化有關(guān)。例如，Schirrmeister［30］等人發(fā)現(xiàn)，藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi) rrs的拷貝數(shù)的增加與其末端分化相關(guān)，藍(lán)細(xì)菌門(mén)細(xì)胞內(nèi)rrs的拷貝數(shù)變異(1～4個(gè))和各拷貝間的異化度也明顯低于其他門(mén)(綠細(xì)菌門(mén)、螺旋體門(mén)和擬桿菌門(mén));Nanamiya［31］證實(shí)，含有單個(gè)rRNA操縱子拷貝的缺失突變體，其生長(zhǎng)明顯變慢，產(chǎn)芽胞率降低1至4個(gè)數(shù)量級(jí)。但總體上講，目前對(duì)原核生物基因組內(nèi)rrs拷貝數(shù)及其異化的生物學(xué)意義了解還是初步的，相信更多原核生物的基因組學(xué)研究的深入，將能全面揭示其對(duì)原核生物適應(yīng)環(huán)境的意義［32］。另外，原核生物rrs拷貝數(shù)及其異化的研究對(duì)于避免菌種鑒定錯(cuò)誤、糾正對(duì)原核生物豐度和多樣性的高估也具有重要意義［2，33-36］。

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