• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    棉花不同外植體對卡那霉素敏感性的研究

    2013-12-03 07:23:08馬玲玲魏延宏朱華國
    生物學(xué)雜志 2013年4期
    關(guān)鍵詞:生長

    馬玲玲,魏延宏,朱華國,張 薇

    (石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院新疆兵團(tuán)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石河子832003)

    隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展,植物遺傳轉(zhuǎn)化已經(jīng)成為應(yīng)用生物學(xué)研究的熱門課題之一[1],基因槍介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化沒有宿主范圍的限制,靶受體類型廣泛,是除農(nóng)桿菌介導(dǎo)法之外應(yīng)用最廣泛的一項(xiàng)遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)[2,3]。在轉(zhuǎn)基因植物中廣泛使用的標(biāo)記基因是卡那霉素抗性基因(nptⅡ),該基因編碼的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPT)能使植物產(chǎn)生抗卡那霉素特性[4],卡那霉素通過干擾植物細(xì)胞葉綠體及線粒體的蛋白質(zhì)合成,引起植物綠色器官的黃化,最終導(dǎo)致植物細(xì)胞的死亡[5]。它在實(shí)驗(yàn)室主要用作區(qū)分轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和非轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的標(biāo)記[6],已報(bào)道利用該選擇標(biāo)記基因超過30個(gè)屬的植物得到了遺傳修飾[7],尤其在棉花等雙子葉植物上的表現(xiàn)很有效。由于不同植物、不同外植體對卡那霉素的反應(yīng)不同[8],轉(zhuǎn)化前對不同外植體進(jìn)行卡那霉素敏感性測定,有助于提高轉(zhuǎn)化時(shí)卡那霉素的抗性篩選效率。

    目前,人們已對棉花的遺傳轉(zhuǎn)化做了較為系統(tǒng)的研究,豇豆、陸地棉下胚軸等材料的卡那霉素敏感性差異有相關(guān)報(bào)道[9-13],但適用于基因槍介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的卡那霉素敏感性研究報(bào)道較少,特別是海島棉莖尖的卡那霉素敏感性研究還未見報(bào)道。本研究以海島棉莖尖、陸地棉莖尖和胚性愈傷組織為試驗(yàn)材料,研究在基因槍法介導(dǎo)的棉花轉(zhuǎn)化體系中不同濃度的卡那霉素對棉花外植體的影響,確定棉花不同外植體的卡那霉素篩選濃度和篩選時(shí)間,為基因槍法介導(dǎo)的棉花遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

    1 材料及方法

    1.1 材料

    新疆自育海島棉品種新海13號、陸地棉品種新陸早33號和新陸早33號的胚性愈傷組織,由石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院作物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室提供。

    1.2 方法

    1.2.1 相關(guān)培養(yǎng)基的配制方法

    MSB培養(yǎng)基即MS無機(jī)鹽+B5維生素;高滲培養(yǎng)基:MSB(0.3 mol/L甘露醇+0.3 mol/L山梨醇);恢復(fù)培養(yǎng)基:MSB培養(yǎng)基;莖尖的生芽培養(yǎng)基:MSB(0.5 mg/L 6-BA);胚性愈傷組織的增殖培養(yǎng)基:MSB(0.5 mg/L IBA+0.15 mg/L KT+1.0 g/L谷氨酰胺+0.5 g/L天冬酰胺+1 g/L活性炭)。培養(yǎng)基中加入2.5 g/L Phytagel,調(diào)整pH值6.0,高壓滅菌后加入卡那霉素溶液,搖勻后分裝。

    1.2.2 莖尖的獲取和培養(yǎng)方法

    莖尖材料來自于暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d、光照培養(yǎng)1 d的無菌苗,在超凈工作臺上無菌切取。切取及放置方法:首先切去微張的2片子葉,然后在距頂端1~1.5 cm的下胚軸處切開,得到長度為1~1.5 cm、含分生組織的莖尖材料。將莖尖進(jìn)行無菌培養(yǎng),豎放在培養(yǎng)基中,下端插入培養(yǎng)基0.5 cm左右,在光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)。繼代方法:切去莖尖下端長有愈傷和褐化的部分,重新豎插到新的培養(yǎng)基上。

    1.2.3 棉花不同外植體的卡那霉素敏感性檢測

    莖尖的生芽培養(yǎng)基設(shè)置7個(gè)Kana濃度梯度:30、60、90、120、150、180 和 210 mg/L,不含 Kana 的為對照組。觀察、記錄不同濃度Kana下莖尖上端芽的生長狀況和Kana反應(yīng)時(shí)間及莖尖下端愈傷組織生長情況和褐化程度。

    胚性愈傷組織(EC)的增殖培養(yǎng)基設(shè)置7個(gè)Kana濃度梯度:30、45、60、75、90 和 105 mg/L,不含 Kana 的為對照組,每瓶培養(yǎng)基取0.1 g生長狀況相近的EC進(jìn)行培養(yǎng)。觀察其生長情況,測定各個(gè)階段胚性愈傷組織的重量。其中,胚性愈傷組織增加的重量=胚性愈傷組織總重量—初始重量。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 海島棉新海13號莖尖再生的卡那霉素敏感性變化

    2.1.1 新海13號莖尖上端(芽)在不同卡那霉素濃度中的反應(yīng)

    生長15 d時(shí),莖尖上端萌芽、長出2~3片葉,對照組葉片生長正常;30~210 mg/L的卡那霉素處理,莖尖上端生長緩慢,葉片出現(xiàn)不同程度的萎縮,嚴(yán)重的整個(gè)葉片干枯死亡,部分老葉片上中部和葉柄部有褐化斑塊、老葉從柄端開始干枯而死(圖1)。生長35 d時(shí),30~210 mg/L的處理,隨著Kana濃度增加,落葉和干枯現(xiàn)象愈加嚴(yán)重,篩選效果較佳,如表1所示.生長60 d時(shí),90~210 mg/L的處理,莖尖上端的葉片全部脫落。

    圖1 莖尖上端在含不同Kana濃度培養(yǎng)基中生長15 d的情況Fig 1 The growth situation of the stem tip top in different kanamycin concentrations for 15d

    2.1.2 新海13號莖尖下端在不同卡那霉素濃度中的反應(yīng)

    莖尖培養(yǎng)時(shí),在莖尖下端會出現(xiàn)愈傷組織生長及褐化現(xiàn)象,由圖2可知:30~90 mg/L的卡那霉素處理,莖尖下端長出愈傷組織,并隨Kana濃度的升高逐漸減少,而且切口處褐化死亡嚴(yán)重;120~180 mg/L的處理,愈傷組織幾乎不生長,但是褐化程度隨Kana濃度的增加而加重。

    圖2 莖尖下端在含不同Kana濃度培養(yǎng)基中生長15 d的情況Fig 2 Changs for the stem tip bottom in different kanamycin concentrations for 15d

    由表1可知,生長35 d時(shí),90~210 mg/L的處理中90%以上的莖尖被嚴(yán)重抑制。120 mg/L的處理,可以排除莖尖下端愈傷組織對莖尖上端的抑制,也可以排除莖尖下端切口處褐化對莖尖上端的影響,也不會影響篩選后莖尖的根誘導(dǎo)。因此,根據(jù)被嚴(yán)重抑制的莖尖比例和培養(yǎng)時(shí)間,結(jié)合下端愈傷組織和褐化的情況,新海13號的Kana敏感性濃度是120 mg/L,35 d即可篩選出抗性莖尖。

    表1 生長35 d(繼代一次)的新海13號莖尖的生長情況Table 1 The growth situation of stem tips which grew for 35d and subcultured once

    2.2 新陸早33號莖尖再生的卡那霉素敏感性變化

    2.2.1 新陸早33號莖尖上端(芽)在不同卡那霉素濃度中的反應(yīng)

    生長20 d時(shí),對照組莖尖上端葉片生長正常;30~210 mg/L卡那霉素處理,莖尖上端出現(xiàn)干枯、萎縮和死亡現(xiàn)象。與新海13號相比,反應(yīng)出現(xiàn)的時(shí)間更早,枯萎的程度更重。30 mg/L的處理,75%的莖尖上端的生長被嚴(yán)重抑制;60 mg/L的處理,大部份莖尖上端的生長被嚴(yán)重抑制;90~210 mg/L的處理,所有的莖尖上端枯萎,濃度越高葉片枯萎現(xiàn)象越嚴(yán)重(圖3-a)。

    2.2.2 新陸早33號莖尖下端在不同卡那霉素濃度中的反應(yīng)

    與新海13號莖尖相似,新陸早33號莖尖下端也長出愈傷組織,下端切口處出現(xiàn)不同的褐化現(xiàn)象。對照組和30~60 mg/L的處理中,莖尖下端的愈傷組織生長嚴(yán)重并呈遞減趨勢,與新海13號莖尖相比,新陸早33號莖尖下端的愈傷組織相對較硬且由莖尖內(nèi)部向外膨脹生長,下端切口處褐化發(fā)黑。90~210 mg/L的處理中,莖尖下端沒有發(fā)育成愈傷組織的現(xiàn)象,切口處的褐化程度隨著Kana濃度的升高加重,嚴(yán)重時(shí)壞死,如圖3-b所示。

    由以上現(xiàn)象和表2中的數(shù)據(jù)可以得出,培養(yǎng)20 d時(shí),新陸早33的莖尖在60 mg/L處理中,大部分莖尖的生長被Kana嚴(yán)重抑制;在90 mg/L處理中,全部莖尖的生長都嚴(yán)重被抑制。60 mg/L處理中莖尖下端愈傷生長嚴(yán)重,抑制了莖尖上端的生長,在篩選后會影響抗性莖尖的生根,因此90 mg/L的處理更合適。相比新海13號莖尖,新陸早33號下端的愈傷組織生長更快,褐化更早、更嚴(yán)重;同時(shí),新陸早33號莖尖的Kana敏感性高于新海13號莖尖。

    圖3 莖尖上端(a)和莖尖下端(b)在含不同Kana濃度培養(yǎng)基中生長20 d的情況Fig 3 The growth situation of the stem tip top(a)and the stem tip bottom(b)for 20d in different kanamycin concentrations

    表2 生長20 d(繼代一次)的新陸早33號莖尖的生長情況Table 2 The growth situation of stem tips which grew for 20d and sub-cultured once

    2.3 新陸早33號胚性愈傷組織再生的卡那霉素敏感性變化

    不同Kana濃度中,新陸早33號的胚性愈傷組織(EC)表面的顏色會發(fā)生明顯變化:培養(yǎng)7 d時(shí),60 mg/L的卡那霉素處理,EC表面會出現(xiàn)淡粉色物質(zhì),60~105 mg/L的卡那霉素處理,隨Kana濃度的增加增多;另外,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,60 mg/L的卡那霉素處理,EC的顏色逐漸變深(如圖4 a→d);培養(yǎng)14 d左右時(shí),顏色開始逐漸變?yōu)楹稚梁谏?培養(yǎng)28 d時(shí),大部分EC發(fā)黑死亡。75 mg/L和90 mg/L的卡那霉素處理,在培養(yǎng)7 d時(shí)褐化嚴(yán)重,胚性愈傷組織幾乎不生長。

    圖4 新陸早33號EC在含60 mg/LKana的培養(yǎng)基中顏色的變化Fig 4 The color changes of EC along with the growth in the medium containing 60 mg/L kanamycin

    胚性愈傷組織(EC)生長4周時(shí),30~45 mg/L的處理中Kana對EC的抑制作用較小,60~105 mg/L的處理中抑制比較明顯(見圖5);EC生長8周時(shí),EC在含Kana的處理中幾乎不生長(見圖6)。在處理6周以后,觀察到在被 Kana抑制的褐色EC中,60~105 mg/L的處理出現(xiàn)了白色和綠色的胚狀體,在含Kana的處理中胚狀體并不褐化死亡。

    由此可以看出,新陸早33號EC的卡那霉素敏感性濃度是60 mg/L。由于EC數(shù)量密集,Kana也不影響EC的分化,篩選過程可以持續(xù)至長出胚狀體。

    3 討論

    3.1 海島棉新海13號莖尖和新陸早33號莖尖在進(jìn)行卡那霉素測試時(shí),莖尖下端愈傷組織的生長,影響莖尖上端的營養(yǎng)吸收能力,抑制了莖尖的萌芽能力,干擾Kana篩選的準(zhǔn)確度;莖尖下端切口處的褐化程度隨Kana濃度的增長加重,高濃度Kana的處理中嚴(yán)重影響莖尖的再生。相對對照組,含有Kana的處理中,莖尖下端的愈傷長勢明顯較弱,并隨Kana濃度的增加而減弱,說明Kana明顯抑制外植體愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖,張獻(xiàn)龍?jiān)诿藁ǖ南嚓P(guān)研究中也曾發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象[12]。

    本試驗(yàn)結(jié)合莖尖愈傷組織的長勢、褐化程度和Kana反應(yīng)程度3個(gè)方面,確定在基因槍的轉(zhuǎn)化處理中新陸早33號莖尖Kana篩選濃度為90 mg/L,篩選時(shí)間為20 d左右;李俊蘭等人研究認(rèn)為下胚軸的卡那霉素的濃度為100 mg/L[13],可推測同一陸地棉品種的下胚軸和莖尖的卡那霉素敏感性差異不大。在棉花莖尖的轉(zhuǎn)化篩選中,莖尖下端切口處的褐化程度可在培養(yǎng)基中加入活性炭(1 g/L)來緩解。培養(yǎng)基中加入活性炭使莖尖迅速萌動,并吸收外植體切口滲出的酚類物質(zhì)[14],減輕莖尖下端的褐化程度。

    3.2 新陸早33號胚性愈傷組織(EC)進(jìn)行卡那霉素篩選時(shí),EC的顏色變化很明顯,由粉色逐漸加深至褐色、黑色。EC表面的粉色物質(zhì)是原花色素物質(zhì),原花色素在自然界的分布廣泛,研究表明它在于油菜籽、葡萄、厚皮香等植物的皮中[15],Kana可能促進(jìn)了 EC中該物質(zhì)的產(chǎn)生。關(guān)于在Kana處理中出現(xiàn)胚狀體這一現(xiàn)象,劉方等人的研究推測一定濃度的Kana影響了新的胚狀體的產(chǎn)生;張文勝等人認(rèn)為,Kana可能與鹽脅迫作用相似,低濃度的鹽對棉花胚胎發(fā)生具有某些促進(jìn)作用[16]。

    [1]劉 方,張寶紅,劉志紅,等.卡那霉素對棉花愈傷組織誘導(dǎo)和生長的影響[J].河南大學(xué)學(xué)報(bào),1999,29(3):84-87.

    [2]McCabe D E,Martinell B J.Transformation of elite cotton cultivar via particle bombardment of meristems[J].Biotechnology,1993,11(5):596-598.

    [3]Finer J J,McMullen M D.Transformation of cotton(Gossypium hirsutum L.)via particle bombardment[J].Plant Cell Reports,1990,8:586-589.

    [4]崔百明,封 玲,王愛英.轉(zhuǎn)基因棉PCR與卡那霉素檢測的比較[J].石河子大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2000,4(2):103-106.

    [5]王紫萱,易自力.卡那霉素在植物轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用及其抗性基因的生物安全性評價(jià).中國生物工程雜志[J].2003,23(6):9-13.

    [6]袁 鷹,劉德璞,王玉民,等.卡那霉素對大豆生長的抑制及篩選試驗(yàn)研究[J].大豆科學(xué),2003,22(4):261-263.

    [7]NaPJ Bijwet J P,Stiekema W J,司守鋼.轉(zhuǎn)基因植物中的卡那霉素抗性[J].生物技術(shù)通報(bào),1998,1:29-31.

    [8]張靜妮,馬暉玲,曹致中.紫花苜蓿不同品種對卡那霉素敏感性分析[J].草原與草坪,2005,5:30-33.

    [9]金仁龍,朱 妹,張邊江.不同培養(yǎng)條件對蘇棉12號莖尖組織培養(yǎng)的影響[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,3:38-39.

    [10]張慧軍,石躍進(jìn),朱永紅,等.棉花轉(zhuǎn)基因工作中利用卡那霉素篩選試管再生株的研究[J].北京農(nóng)業(yè)科學(xué),2001,3:19-20.

    [11]孫英坤,代其林,龔元亞,等.棉花遺傳轉(zhuǎn)化過程中外植體對卡那霉素敏感性的研究[J].吉林農(nóng)業(yè),2011.4(254):61-62.

    [12]張獻(xiàn)龍.抗生素對棉花愈傷組織誘導(dǎo)和生長的影響[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1996,2:123-126.

    [13]李俊蘭,張寒霜,高 鵬,等.卡那霉素對棉花下胚軸愈傷組織生長的影響[J].棉花學(xué)報(bào),1997,9(4):209-212.

    [14]于 婭,劉傳亮,馬峙英,等.適于基因槍轉(zhuǎn)化的棉花莖尖培養(yǎng)及篩選體系初探[J].棉花學(xué)報(bào),2003,15(5):274-278.

    [15]張長貴,董加寶,王禎旭.原花色素及其開發(fā)應(yīng)用[J].四川食品和發(fā)酵,2006,42(129):8-12.

    [16]張文勝,張寶紅,李秀蘭,等.鹽脅迫對棉花胚性愈傷組織增殖、胚胎發(fā)生及發(fā)育的影響[J].棉花學(xué)報(bào),1996,8(4):189-192.

    猜你喜歡
    生長
    野蠻生長
    碗蓮生長記
    小讀者(2021年2期)2021-03-29 05:03:48
    生長的樹
    自由生長的家
    美是不斷生長的
    快速生長劑
    共享出行不再“野蠻生長”
    生長在哪里的啟示
    野蠻生長
    NBA特刊(2018年21期)2018-11-24 02:48:04
    生長
    文苑(2018年22期)2018-11-19 02:54:14
    人人妻人人添人人爽欧美一区卜 | 精品久久国产蜜桃| 蜜臀久久99精品久久宅男| 国产伦精品一区二区三区四那| 一级av片app| 国产 精品1| 99久久综合免费| 视频中文字幕在线观看| 亚洲av男天堂| 日韩人妻高清精品专区| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 中文字幕久久专区| 韩国高清视频一区二区三区| 成人无遮挡网站| 激情五月婷婷亚洲| 亚洲伊人久久精品综合| 日韩av不卡免费在线播放| 国产精品一区二区性色av| 日本午夜av视频| 多毛熟女@视频| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 久久99热6这里只有精品| 国产成人精品一,二区| 九草在线视频观看| 久久99精品国语久久久| 99热网站在线观看| 美女内射精品一级片tv| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 精品酒店卫生间| 少妇人妻一区二区三区视频| 日本av手机在线免费观看| 秋霞在线观看毛片| 久热这里只有精品99| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 国产男女超爽视频在线观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 久久久久久久精品精品| 尾随美女入室| 在线精品无人区一区二区三 | 麻豆国产97在线/欧美| 91精品国产国语对白视频| 欧美精品亚洲一区二区| 国产爽快片一区二区三区| 午夜免费男女啪啪视频观看| 久久久久久久久久久免费av| 欧美精品一区二区大全| 日韩精品有码人妻一区| xxx大片免费视频| 国产成人精品婷婷| 99九九线精品视频在线观看视频| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲成人手机| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 国产黄片美女视频| 国产爱豆传媒在线观看| 日本午夜av视频| 街头女战士在线观看网站| 国产色爽女视频免费观看| 久久久久久久国产电影| 免费看av在线观看网站| av黄色大香蕉| 中文资源天堂在线| 黑丝袜美女国产一区| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 日本与韩国留学比较| 久久久亚洲精品成人影院| 欧美日韩在线观看h| 国产精品偷伦视频观看了| 看非洲黑人一级黄片| 久久精品国产自在天天线| 一级片'在线观看视频| 深爱激情五月婷婷| 大香蕉97超碰在线| 熟妇人妻不卡中文字幕| 精品一区二区三卡| 五月开心婷婷网| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 亚洲国产精品专区欧美| 国产高清国产精品国产三级 | 亚洲美女搞黄在线观看| 久久精品国产亚洲网站| 少妇熟女欧美另类| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲人成网站在线观看播放| 亚洲第一av免费看| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 日韩一区二区三区影片| 日日啪夜夜爽| 十八禁网站网址无遮挡 | 女性生殖器流出的白浆| 天堂中文最新版在线下载| 在线观看一区二区三区| 2018国产大陆天天弄谢| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 一区二区三区免费毛片| 天天躁日日操中文字幕| 国产乱来视频区| 精品亚洲成国产av| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 黑丝袜美女国产一区| 在线观看av片永久免费下载| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 欧美日韩精品成人综合77777| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 久久精品久久精品一区二区三区| 午夜激情福利司机影院| 国产成人a区在线观看| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产探花极品一区二区| 日本免费在线观看一区| 国产高潮美女av| 在线观看一区二区三区| 亚洲综合色惰| 精品少妇久久久久久888优播| 亚洲国产色片| 国产乱人偷精品视频| 久久亚洲国产成人精品v| 亚洲国产日韩一区二区| 高清午夜精品一区二区三区| .国产精品久久| 五月开心婷婷网| 一个人看的www免费观看视频| av天堂中文字幕网| 女人久久www免费人成看片| 国产成人一区二区在线| h日本视频在线播放| 久久久久久九九精品二区国产| 插逼视频在线观看| 黄色日韩在线| 久久热精品热| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 91aial.com中文字幕在线观看| 黄片无遮挡物在线观看| 美女国产视频在线观看| 精品国产三级普通话版| 日韩强制内射视频| 久久97久久精品| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国产乱来视频区| 亚洲在久久综合| 成人黄色视频免费在线看| 午夜免费鲁丝| 国产精品蜜桃在线观看| av在线蜜桃| 有码 亚洲区| 99热全是精品| 黑丝袜美女国产一区| 国产成人精品婷婷| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 大香蕉久久网| 精品午夜福利在线看| 国产精品99久久99久久久不卡 | 色视频www国产| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 各种免费的搞黄视频| av女优亚洲男人天堂| 国产av一区二区精品久久 | 国产精品熟女久久久久浪| 在线观看免费视频网站a站| 日本与韩国留学比较| 在线观看免费高清a一片| 国产大屁股一区二区在线视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 免费av中文字幕在线| 热re99久久精品国产66热6| 黄色日韩在线| 久久ye,这里只有精品| 91精品国产九色| 波野结衣二区三区在线| 日韩av免费高清视频| 欧美3d第一页| 亚洲第一区二区三区不卡| 有码 亚洲区| 免费看日本二区| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产亚洲91精品色在线| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 国产欧美亚洲国产| 国产亚洲欧美精品永久| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产熟女欧美一区二区| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 高清毛片免费看| 男女免费视频国产| 欧美zozozo另类| av在线老鸭窝| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产日韩欧美在线精品| 日本与韩国留学比较| 亚洲国产最新在线播放| 内射极品少妇av片p| 99热网站在线观看| 国产视频内射| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 啦啦啦在线观看免费高清www| 三级国产精品片| 国产精品.久久久| 久久人人爽人人爽人人片va| 国产爽快片一区二区三区| 永久免费av网站大全| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 97在线人人人人妻| 国产一区二区三区av在线| 春色校园在线视频观看| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 亚洲自偷自拍三级| 午夜精品国产一区二区电影| 中文字幕av成人在线电影| 亚洲,一卡二卡三卡| 一级爰片在线观看| 99热国产这里只有精品6| 99久国产av精品国产电影| 欧美日本视频| 精品久久久久久电影网| 国产中年淑女户外野战色| 亚洲色图av天堂| 日韩av免费高清视频| 18禁动态无遮挡网站| 成人毛片60女人毛片免费| 青春草亚洲视频在线观看| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 久久国产乱子免费精品| 亚洲国产精品成人久久小说| 久久久久久久久久人人人人人人| 视频中文字幕在线观看| 赤兔流量卡办理| 欧美日韩在线观看h| 大香蕉97超碰在线| 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲国产欧美人成| 欧美极品一区二区三区四区| 日韩欧美 国产精品| 成人漫画全彩无遮挡| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 国产黄色免费在线视频| 男人和女人高潮做爰伦理| 麻豆成人av视频| 日日撸夜夜添| 免费看日本二区| av.在线天堂| 一级毛片久久久久久久久女| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产一区二区三区av在线| 我要看黄色一级片免费的| 日韩成人伦理影院| 有码 亚洲区| 中文字幕亚洲精品专区| 国产精品成人在线| 51国产日韩欧美| 国产在线视频一区二区| 亚洲精品国产成人久久av| 精品亚洲成国产av| 草草在线视频免费看| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 天堂8中文在线网| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 色婷婷av一区二区三区视频| 国产精品蜜桃在线观看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 日本一二三区视频观看| 亚洲经典国产精华液单| 国产av国产精品国产| av视频免费观看在线观看| 美女国产视频在线观看| 亚洲不卡免费看| 免费高清在线观看视频在线观看| 下体分泌物呈黄色| 欧美xxⅹ黑人| 免费观看无遮挡的男女| 国产精品不卡视频一区二区| 九色成人免费人妻av| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 简卡轻食公司| 天堂中文最新版在线下载| 国产成人免费无遮挡视频| 日韩在线高清观看一区二区三区| 亚洲国产欧美人成| 国产淫语在线视频| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 国产v大片淫在线免费观看| 交换朋友夫妻互换小说| 国产精品熟女久久久久浪| 看十八女毛片水多多多| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产av一区二区精品久久 | 99久国产av精品国产电影| 亚洲欧美日韩东京热| 一级毛片电影观看| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 亚洲人成网站高清观看| 精品久久久久久电影网| 九九爱精品视频在线观看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 五月天丁香电影| 免费看不卡的av| 少妇被粗大猛烈的视频| 一个人免费看片子| 91精品一卡2卡3卡4卡| 两个人的视频大全免费| 成人影院久久| 韩国高清视频一区二区三区| 久久精品国产亚洲av涩爱| av免费观看日本| 久久精品久久精品一区二区三区| 丝袜喷水一区| 一区二区三区精品91| 大片免费播放器 马上看| 一级爰片在线观看| 久久热精品热| 91久久精品国产一区二区三区| 国产精品久久久久久精品古装| 三级经典国产精品| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 青春草国产在线视频| 免费看不卡的av| 又大又黄又爽视频免费| 日韩欧美精品免费久久| 热re99久久精品国产66热6| 国产欧美亚洲国产| 久久久久视频综合| 下体分泌物呈黄色| 国产精品99久久久久久久久| 日韩中字成人| 一级毛片我不卡| 在线观看免费视频网站a站| 日韩av在线免费看完整版不卡| 日本av手机在线免费观看| videos熟女内射| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 久久久久久久久久久免费av| 久久久久久伊人网av| 在线 av 中文字幕| 亚洲性久久影院| 亚洲美女黄色视频免费看| 亚洲,一卡二卡三卡| 干丝袜人妻中文字幕| 亚洲国产日韩一区二区| 最近最新中文字幕免费大全7| 日本欧美国产在线视频| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 久久久久国产精品人妻一区二区| 男女无遮挡免费网站观看| 午夜日本视频在线| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产精品久久久久久精品古装| 大陆偷拍与自拍| 男女边吃奶边做爰视频| 特大巨黑吊av在线直播| 日本免费在线观看一区| 欧美另类一区| 亚洲精品456在线播放app| 老司机影院毛片| 精品久久国产蜜桃| 极品教师在线视频| 日本黄大片高清| 欧美一区二区亚洲| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 欧美日韩亚洲高清精品| 久久精品国产自在天天线| 香蕉精品网在线| 欧美精品一区二区免费开放| 免费看av在线观看网站| 最黄视频免费看| 男人狂女人下面高潮的视频| 久久精品国产自在天天线| 亚洲av不卡在线观看| 观看av在线不卡| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 亚洲美女黄色视频免费看| 国产精品国产三级国产专区5o| av网站免费在线观看视频| av不卡在线播放| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 高清欧美精品videossex| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 国内精品宾馆在线| 国产免费一级a男人的天堂| 亚洲四区av| 精品熟女少妇av免费看| 我要看黄色一级片免费的| 日本-黄色视频高清免费观看| 高清欧美精品videossex| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 午夜老司机福利剧场| 久久久久久久久久人人人人人人| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产高清不卡午夜福利| 一二三四中文在线观看免费高清| 黄色一级大片看看| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 成人免费观看视频高清| 亚洲va在线va天堂va国产| av.在线天堂| 日韩亚洲欧美综合| 中文字幕av成人在线电影| 狂野欧美激情性bbbbbb| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 久久精品久久久久久久性| 久久国产乱子免费精品| 丝瓜视频免费看黄片| 成人国产麻豆网| 九九爱精品视频在线观看| 亚洲伊人久久精品综合| 黄色欧美视频在线观看| 一级毛片电影观看| 亚洲久久久国产精品| 天美传媒精品一区二区| 亚洲经典国产精华液单| 美女cb高潮喷水在线观看| av.在线天堂| 精品一区二区三区视频在线| 日日啪夜夜撸| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产日韩欧美亚洲二区| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产伦精品一区二区三区四那| 日韩强制内射视频| 久久鲁丝午夜福利片| 美女福利国产在线 | 免费大片18禁| 十八禁网站网址无遮挡 | 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 日本vs欧美在线观看视频 | 大话2 男鬼变身卡| 在线免费观看不下载黄p国产| 亚洲真实伦在线观看| 热re99久久精品国产66热6| 欧美日韩精品成人综合77777| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 亚洲综合色惰| 成人一区二区视频在线观看| 国产高清国产精品国产三级 | 国产黄片美女视频| 2021少妇久久久久久久久久久| 中文天堂在线官网| 干丝袜人妻中文字幕| 少妇丰满av| 精品亚洲成a人片在线观看 | 99re6热这里在线精品视频| 久久 成人 亚洲| 夫妻性生交免费视频一级片| 老司机影院成人| 精品人妻偷拍中文字幕| 欧美3d第一页| 久久久成人免费电影| 99热这里只有是精品50| 欧美一区二区亚洲| a级一级毛片免费在线观看| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 乱码一卡2卡4卡精品| 亚洲美女视频黄频| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产精品福利在线免费观看| 国产片特级美女逼逼视频| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 欧美日本视频| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 精品亚洲成国产av| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 国产精品久久久久久精品古装| 亚洲精品视频女| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产av码专区亚洲av| 天天躁日日操中文字幕| 免费看光身美女| 国产精品女同一区二区软件| 97超碰精品成人国产| 国产男女内射视频| 国产成人a区在线观看| 97超视频在线观看视频| 直男gayav资源| 最黄视频免费看| 亚洲精品国产av蜜桃| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 免费黄频网站在线观看国产| 久久ye,这里只有精品| 岛国毛片在线播放| 免费观看的影片在线观看| 日韩人妻高清精品专区| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 最黄视频免费看| 最近最新中文字幕大全电影3| 欧美国产精品一级二级三级 | 精品国产乱码久久久久久小说| 高清在线视频一区二区三区| 欧美国产精品一级二级三级 | 精品国产乱码久久久久久小说| 观看免费一级毛片| av一本久久久久| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲四区av| 国产黄频视频在线观看| 国产日韩欧美亚洲二区| av一本久久久久| 精品酒店卫生间| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产 一区精品| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 黑人猛操日本美女一级片| 看免费成人av毛片| 国产精品久久久久成人av| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 日本欧美国产在线视频| 亚洲精品自拍成人| 老熟女久久久| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 久久久a久久爽久久v久久| 日韩大片免费观看网站| 国产又色又爽无遮挡免| 精品久久久久久久末码| 午夜福利高清视频| 久久久久久久国产电影| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 国产在线男女| 一区二区三区四区激情视频| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 春色校园在线视频观看| 亚洲精品,欧美精品| 国产乱人偷精品视频| 一级a做视频免费观看| 国产伦在线观看视频一区| 一区二区三区免费毛片| 久久久午夜欧美精品| 久久精品国产a三级三级三级| 国国产精品蜜臀av免费| 亚洲无线观看免费| 美女内射精品一级片tv| 两个人的视频大全免费| 日韩亚洲欧美综合| 亚洲精品,欧美精品| videos熟女内射| 中国国产av一级| 黑丝袜美女国产一区| 一级黄片播放器| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 亚洲,一卡二卡三卡| 在线天堂最新版资源| 国产亚洲一区二区精品| 久久久久视频综合| 国产在线视频一区二区| 国产精品嫩草影院av在线观看| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 97在线人人人人妻| 一级二级三级毛片免费看| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 狂野欧美激情性bbbbbb| 精品一区二区免费观看| 亚洲精品一二三| 成人无遮挡网站| 一区二区三区精品91| 免费黄频网站在线观看国产| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 制服丝袜香蕉在线| 18禁动态无遮挡网站| 色哟哟·www| 亚洲av二区三区四区| 日韩 亚洲 欧美在线| 精品国产三级普通话版| 国产又色又爽无遮挡免| 亚洲精品国产av成人精品| 2022亚洲国产成人精品| 中文在线观看免费www的网站| 久久影院123| 久久人妻熟女aⅴ| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 亚洲在久久综合| 日韩亚洲欧美综合| 少妇丰满av| 国产又色又爽无遮挡免| 日韩欧美精品免费久久| 只有这里有精品99| 中文在线观看免费www的网站| 天堂8中文在线网| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 亚洲欧美日韩东京热| 在线 av 中文字幕| 亚洲av成人精品一二三区| 少妇的逼水好多| 午夜老司机福利剧场| 精品人妻视频免费看| 丝袜喷水一区| av国产精品久久久久影院| 亚洲国产高清在线一区二区三| 干丝袜人妻中文字幕| 在线观看三级黄色| 国产伦在线观看视频一区| 亚洲欧美清纯卡通| 国产一区二区在线观看日韩| 亚洲人成网站在线观看播放| 能在线免费看毛片的网站| 少妇人妻一区二区三区视频| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 亚洲成人手机| 国产亚洲5aaaaa淫片| 国产一区有黄有色的免费视频| 亚洲,一卡二卡三卡| 日本免费在线观看一区| 熟女人妻精品中文字幕| 国产精品福利在线免费观看| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产精品人妻久久久影院| 少妇的逼水好多| av国产精品久久久久影院| 99视频精品全部免费 在线| 99久国产av精品国产电影| 午夜福利在线在线| 国产精品伦人一区二区|