棉花不同外植體對卡那霉素敏感性的研究

馬玲玲，魏延宏，朱華國，張 薇

(石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院新疆兵團(tuán)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子832003)

隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，植物遺傳轉(zhuǎn)化已經(jīng)成為應(yīng)用生物學(xué)研究的熱門課題之一［1］，基因槍介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化沒有宿主范圍的限制，靶受體類型廣泛，是除農(nóng)桿菌介導(dǎo)法之外應(yīng)用最廣泛的一項(xiàng)遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)［2，3］。在轉(zhuǎn)基因植物中廣泛使用的標(biāo)記基因是卡那霉素抗性基因(nptⅡ)，該基因編碼的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPT)能使植物產(chǎn)生抗卡那霉素特性［4］，卡那霉素通過干擾植物細(xì)胞葉綠體及線粒體的蛋白質(zhì)合成，引起植物綠色器官的黃化，最終導(dǎo)致植物細(xì)胞的死亡［5］。它在實(shí)驗(yàn)室主要用作區(qū)分轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和非轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的標(biāo)記［6］，已報(bào)道利用該選擇標(biāo)記基因超過30個(gè)屬的植物得到了遺傳修飾［7］，尤其在棉花等雙子葉植物上的表現(xiàn)很有效。由于不同植物、不同外植體對卡那霉素的反應(yīng)不同［8］，轉(zhuǎn)化前對不同外植體進(jìn)行卡那霉素敏感性測定，有助于提高轉(zhuǎn)化時(shí)卡那霉素的抗性篩選效率。

目前，人們已對棉花的遺傳轉(zhuǎn)化做了較為系統(tǒng)的研究，豇豆、陸地棉下胚軸等材料的卡那霉素敏感性差異有相關(guān)報(bào)道［9-13］，但適用于基因槍介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的卡那霉素敏感性研究報(bào)道較少，特別是海島棉莖尖的卡那霉素敏感性研究還未見報(bào)道。本研究以海島棉莖尖、陸地棉莖尖和胚性愈傷組織為試驗(yàn)材料，研究在基因槍法介導(dǎo)的棉花轉(zhuǎn)化體系中不同濃度的卡那霉素對棉花外植體的影響，確定棉花不同外植體的卡那霉素篩選濃度和篩選時(shí)間，為基因槍法介導(dǎo)的棉花遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料及方法

1.1 材料

新疆自育海島棉品種新海13號、陸地棉品種新陸早33號和新陸早33號的胚性愈傷組織，由石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院作物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 相關(guān)培養(yǎng)基的配制方法

MSB培養(yǎng)基即MS無機(jī)鹽+B5維生素;高滲培養(yǎng)基:MSB(0.3 mol/L甘露醇+0.3 mol/L山梨醇);恢復(fù)培養(yǎng)基:MSB培養(yǎng)基;莖尖的生芽培養(yǎng)基:MSB(0.5 mg/L 6-BA);胚性愈傷組織的增殖培養(yǎng)基:MSB(0.5 mg/L IBA+0.15 mg/L KT+1.0 g/L谷氨酰胺+0.5 g/L天冬酰胺+1 g/L活性炭)。培養(yǎng)基中加入2.5 g/L Phytagel，調(diào)整pH值6.0，高壓滅菌后加入卡那霉素溶液，搖勻后分裝。

1.2.2 莖尖的獲取和培養(yǎng)方法

莖尖材料來自于暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d、光照培養(yǎng)1 d的無菌苗，在超凈工作臺上無菌切取。切取及放置方法:首先切去微張的2片子葉，然后在距頂端1～1.5 cm的下胚軸處切開，得到長度為1～1.5 cm、含分生組織的莖尖材料。將莖尖進(jìn)行無菌培養(yǎng)，豎放在培養(yǎng)基中，下端插入培養(yǎng)基0.5 cm左右，在光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)。繼代方法:切去莖尖下端長有愈傷和褐化的部分，重新豎插到新的培養(yǎng)基上。

1.2.3 棉花不同外植體的卡那霉素敏感性檢測

莖尖的生芽培養(yǎng)基設(shè)置7個(gè)Kana濃度梯度:30、60、90、120、150、180 和 210 mg/L，不含 Kana 的為對照組。觀察、記錄不同濃度Kana下莖尖上端芽的生長狀況和Kana反應(yīng)時(shí)間及莖尖下端愈傷組織生長情況和褐化程度。

胚性愈傷組織(EC)的增殖培養(yǎng)基設(shè)置7個(gè)Kana濃度梯度:30、45、60、75、90 和 105 mg/L，不含 Kana 的為對照組，每瓶培養(yǎng)基取0.1 g生長狀況相近的EC進(jìn)行培養(yǎng)。觀察其生長情況，測定各個(gè)階段胚性愈傷組織的重量。其中，胚性愈傷組織增加的重量=胚性愈傷組織總重量—初始重量。

2 結(jié)果與分析

2.1 海島棉新海13號莖尖再生的卡那霉素敏感性變化

2.1.1 新海13號莖尖上端(芽)在不同卡那霉素濃度中的反應(yīng)

生長15 d時(shí)，莖尖上端萌芽、長出2～3片葉，對照組葉片生長正常;30～210 mg/L的卡那霉素處理，莖尖上端生長緩慢，葉片出現(xiàn)不同程度的萎縮，嚴(yán)重的整個(gè)葉片干枯死亡，部分老葉片上中部和葉柄部有褐化斑塊、老葉從柄端開始干枯而死(圖1)。生長35 d時(shí)，30～210 mg/L的處理，隨著Kana濃度增加，落葉和干枯現(xiàn)象愈加嚴(yán)重，篩選效果較佳，如表1所示.生長60 d時(shí)，90～210 mg/L的處理，莖尖上端的葉片全部脫落。

圖1 莖尖上端在含不同Kana濃度培養(yǎng)基中生長15 d的情況Fig 1 The growth situation of the stem tip top in different kanamycin concentrations for 15d

2.1.2 新海13號莖尖下端在不同卡那霉素濃度中的反應(yīng)

莖尖培養(yǎng)時(shí)，在莖尖下端會出現(xiàn)愈傷組織生長及褐化現(xiàn)象，由圖2可知:30～90 mg/L的卡那霉素處理，莖尖下端長出愈傷組織，并隨Kana濃度的升高逐漸減少，而且切口處褐化死亡嚴(yán)重;120～180 mg/L的處理，愈傷組織幾乎不生長，但是褐化程度隨Kana濃度的增加而加重。

圖2 莖尖下端在含不同Kana濃度培養(yǎng)基中生長15 d的情況Fig 2 Changs for the stem tip bottom in different kanamycin concentrations for 15d

由表1可知，生長35 d時(shí)，90～210 mg/L的處理中90%以上的莖尖被嚴(yán)重抑制。120 mg/L的處理，可以排除莖尖下端愈傷組織對莖尖上端的抑制，也可以排除莖尖下端切口處褐化對莖尖上端的影響，也不會影響篩選后莖尖的根誘導(dǎo)。因此，根據(jù)被嚴(yán)重抑制的莖尖比例和培養(yǎng)時(shí)間，結(jié)合下端愈傷組織和褐化的情況，新海13號的Kana敏感性濃度是120 mg/L，35 d即可篩選出抗性莖尖。

表1 生長35 d(繼代一次)的新海13號莖尖的生長情況Table 1 The growth situation of stem tips which grew for 35d and subcultured once

2.2 新陸早33號莖尖再生的卡那霉素敏感性變化

2.2.1 新陸早33號莖尖上端(芽)在不同卡那霉素濃度中的反應(yīng)

生長20 d時(shí)，對照組莖尖上端葉片生長正常;30～210 mg/L卡那霉素處理，莖尖上端出現(xiàn)干枯、萎縮和死亡現(xiàn)象。與新海13號相比，反應(yīng)出現(xiàn)的時(shí)間更早，枯萎的程度更重。30 mg/L的處理，75%的莖尖上端的生長被嚴(yán)重抑制;60 mg/L的處理，大部份莖尖上端的生長被嚴(yán)重抑制;90～210 mg/L的處理，所有的莖尖上端枯萎，濃度越高葉片枯萎現(xiàn)象越嚴(yán)重(圖3-a)。

2.2.2 新陸早33號莖尖下端在不同卡那霉素濃度中的反應(yīng)

與新海13號莖尖相似，新陸早33號莖尖下端也長出愈傷組織，下端切口處出現(xiàn)不同的褐化現(xiàn)象。對照組和30～60 mg/L的處理中，莖尖下端的愈傷組織生長嚴(yán)重并呈遞減趨勢，與新海13號莖尖相比，新陸早33號莖尖下端的愈傷組織相對較硬且由莖尖內(nèi)部向外膨脹生長，下端切口處褐化發(fā)黑。90～210 mg/L的處理中，莖尖下端沒有發(fā)育成愈傷組織的現(xiàn)象，切口處的褐化程度隨著Kana濃度的升高加重，嚴(yán)重時(shí)壞死，如圖3-b所示。

由以上現(xiàn)象和表2中的數(shù)據(jù)可以得出，培養(yǎng)20 d時(shí)，新陸早33的莖尖在60 mg/L處理中，大部分莖尖的生長被Kana嚴(yán)重抑制;在90 mg/L處理中，全部莖尖的生長都嚴(yán)重被抑制。60 mg/L處理中莖尖下端愈傷生長嚴(yán)重，抑制了莖尖上端的生長，在篩選后會影響抗性莖尖的生根，因此90 mg/L的處理更合適。相比新海13號莖尖，新陸早33號下端的愈傷組織生長更快，褐化更早、更嚴(yán)重;同時(shí)，新陸早33號莖尖的Kana敏感性高于新海13號莖尖。

圖3 莖尖上端(a)和莖尖下端(b)在含不同Kana濃度培養(yǎng)基中生長20 d的情況Fig 3 The growth situation of the stem tip top(a)and the stem tip bottom(b)for 20d in different kanamycin concentrations

表2 生長20 d(繼代一次)的新陸早33號莖尖的生長情況Table 2 The growth situation of stem tips which grew for 20d and sub-cultured once

2.3 新陸早33號胚性愈傷組織再生的卡那霉素敏感性變化

不同Kana濃度中，新陸早33號的胚性愈傷組織(EC)表面的顏色會發(fā)生明顯變化:培養(yǎng)7 d時(shí)，60 mg/L的卡那霉素處理，EC表面會出現(xiàn)淡粉色物質(zhì)，60～105 mg/L的卡那霉素處理，隨Kana濃度的增加增多;另外，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，60 mg/L的卡那霉素處理，EC的顏色逐漸變深(如圖4 a→d);培養(yǎng)14 d左右時(shí)，顏色開始逐漸變?yōu)楹稚梁谏?培養(yǎng)28 d時(shí)，大部分EC發(fā)黑死亡。75 mg/L和90 mg/L的卡那霉素處理，在培養(yǎng)7 d時(shí)褐化嚴(yán)重，胚性愈傷組織幾乎不生長。

圖4 新陸早33號EC在含60 mg/LKana的培養(yǎng)基中顏色的變化Fig 4 The color changes of EC along with the growth in the medium containing 60 mg/L kanamycin

胚性愈傷組織(EC)生長4周時(shí)，30～45 mg/L的處理中Kana對EC的抑制作用較小，60～105 mg/L的處理中抑制比較明顯(見圖5);EC生長8周時(shí)，EC在含Kana的處理中幾乎不生長(見圖6)。在處理6周以后，觀察到在被 Kana抑制的褐色EC中，60～105 mg/L的處理出現(xiàn)了白色和綠色的胚狀體，在含Kana的處理中胚狀體并不褐化死亡。

由此可以看出，新陸早33號EC的卡那霉素敏感性濃度是60 mg/L。由于EC數(shù)量密集，Kana也不影響EC的分化，篩選過程可以持續(xù)至長出胚狀體。

3 討論

3.1 海島棉新海13號莖尖和新陸早33號莖尖在進(jìn)行卡那霉素測試時(shí)，莖尖下端愈傷組織的生長，影響莖尖上端的營養(yǎng)吸收能力，抑制了莖尖的萌芽能力，干擾Kana篩選的準(zhǔn)確度;莖尖下端切口處的褐化程度隨Kana濃度的增長加重，高濃度Kana的處理中嚴(yán)重影響莖尖的再生。相對對照組，含有Kana的處理中，莖尖下端的愈傷長勢明顯較弱，并隨Kana濃度的增加而減弱，說明Kana明顯抑制外植體愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖，張獻(xiàn)龍?jiān)诿藁ǖ南嚓P(guān)研究中也曾發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象［12］。

本試驗(yàn)結(jié)合莖尖愈傷組織的長勢、褐化程度和Kana反應(yīng)程度3個(gè)方面，確定在基因槍的轉(zhuǎn)化處理中新陸早33號莖尖Kana篩選濃度為90 mg/L，篩選時(shí)間為20 d左右;李俊蘭等人研究認(rèn)為下胚軸的卡那霉素的濃度為100 mg/L［13］，可推測同一陸地棉品種的下胚軸和莖尖的卡那霉素敏感性差異不大。在棉花莖尖的轉(zhuǎn)化篩選中，莖尖下端切口處的褐化程度可在培養(yǎng)基中加入活性炭(1 g/L)來緩解。培養(yǎng)基中加入活性炭使莖尖迅速萌動，并吸收外植體切口滲出的酚類物質(zhì)［14］，減輕莖尖下端的褐化程度。

3.2 新陸早33號胚性愈傷組織(EC)進(jìn)行卡那霉素篩選時(shí)，EC的顏色變化很明顯，由粉色逐漸加深至褐色、黑色。EC表面的粉色物質(zhì)是原花色素物質(zhì)，原花色素在自然界的分布廣泛，研究表明它在于油菜籽、葡萄、厚皮香等植物的皮中［15］，Kana可能促進(jìn)了 EC中該物質(zhì)的產(chǎn)生。關(guān)于在Kana處理中出現(xiàn)胚狀體這一現(xiàn)象，劉方等人的研究推測一定濃度的Kana影響了新的胚狀體的產(chǎn)生;張文勝等人認(rèn)為，Kana可能與鹽脅迫作用相似，低濃度的鹽對棉花胚胎發(fā)生具有某些促進(jìn)作用［16］。

［1］劉 方，張寶紅，劉志紅，等.卡那霉素對棉花愈傷組織誘導(dǎo)和生長的影響［J］.河南大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，29(3):84-87.

［2］McCabe D E，Martinell B J.Transformation of elite cotton cultivar via particle bombardment of meristems［J］.Biotechnology，1993，11(5):596-598.

［3］Finer J J，McMullen M D.Transformation of cotton(Gossypium hirsutum L.)via particle bombardment［J］.Plant Cell Reports，1990，8:586-589.

［4］崔百明，封 玲，王愛英.轉(zhuǎn)基因棉PCR與卡那霉素檢測的比較［J］.石河子大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2000，4(2):103-106.

［5］王紫萱，易自力.卡那霉素在植物轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用及其抗性基因的生物安全性評價(jià).中國生物工程雜志［J］.2003，23(6):9-13.

［6］袁 鷹，劉德璞，王玉民，等.卡那霉素對大豆生長的抑制及篩選試驗(yàn)研究［J］.大豆科學(xué)，2003，22(4):261-263.

［7］NaPJ Bijwet J P，Stiekema W J，司守鋼.轉(zhuǎn)基因植物中的卡那霉素抗性［J］.生物技術(shù)通報(bào)，1998，1:29-31.

［8］張靜妮，馬暉玲，曹致中.紫花苜蓿不同品種對卡那霉素敏感性分析［J］.草原與草坪，2005，5:30-33.

［9］金仁龍，朱 妹，張邊江.不同培養(yǎng)條件對蘇棉12號莖尖組織培養(yǎng)的影響［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，3:38-39.

［10］張慧軍，石躍進(jìn)，朱永紅，等.棉花轉(zhuǎn)基因工作中利用卡那霉素篩選試管再生株的研究［J］.北京農(nóng)業(yè)科學(xué)，2001，3:19-20.

［11］孫英坤，代其林，龔元亞，等.棉花遺傳轉(zhuǎn)化過程中外植體對卡那霉素敏感性的研究［J］.吉林農(nóng)業(yè)，2011.4(254):61-62.

［12］張獻(xiàn)龍.抗生素對棉花愈傷組織誘導(dǎo)和生長的影響［J］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1996，2:123-126.

［13］李俊蘭，張寒霜，高 鵬，等.卡那霉素對棉花下胚軸愈傷組織生長的影響［J］.棉花學(xué)報(bào)，1997，9(4):209-212.

［14］于 婭，劉傳亮，馬峙英，等.適于基因槍轉(zhuǎn)化的棉花莖尖培養(yǎng)及篩選體系初探［J］.棉花學(xué)報(bào)，2003，15(5):274-278.

［15］張長貴，董加寶，王禎旭.原花色素及其開發(fā)應(yīng)用［J］.四川食品和發(fā)酵，2006，42(129):8-12.

［16］張文勝，張寶紅，李秀蘭，等.鹽脅迫對棉花胚性愈傷組織增殖、胚胎發(fā)生及發(fā)育的影響［J］.棉花學(xué)報(bào)，1996，8(4):189-192.