苯并［a］芘和鎘暴露對食蚊魚求偶行為的影響

蘇 方，謝勇平，方展強

(華南師范大學生命科學學院廣東省高等學校生態(tài)與環(huán)境科學重點實驗室，廣州510631)

隨著工業(yè)的快速發(fā)展，向水環(huán)境排放污染物的種類和數(shù)量也越來越多。研究表明，一些污染物影響水生脊椎動物生長發(fā)育的內分泌調節(jié)過程［1］，這些污染物被稱為環(huán)境內分泌干擾物(Endocrine-Disrupting Chemicals，簡稱EDCs)。其中多環(huán)芳烴(PAHs)如苯并〔a〕芘(BaP)是一種很強的致畸、致突變劑和內分泌干擾物［2，3］，已有研究表明，BaP主要影響動物的雄激素分泌系統(tǒng)［4］。鎘(Cadmium，Cd)是常見的環(huán)境和工業(yè)污染物，鎘離子(Cd2+)有一定的致癌和致突變特性［5］。一些研究也表明Cd2+具有雌激素活性，也影響雌激素分泌［2，6］。食蚊魚(Gambusia affinis)屬鳉形目，胎鳉科，食蚊魚屬，原產(chǎn)于中南美，后引入中國，因嗜吃蚊子幼蟲而得名［7］。食蚊魚分布廣泛，能夠耐受很多不同的環(huán)境同時能夠生存在污染較嚴重的水體中。雄性食蚊魚是非常理想的監(jiān)測水體中EDCs的指示生物，它們在雄激素或雌激素的控制下所產(chǎn)生的性別特征非常容易區(qū)別［8-10］。因此，本課題選取食蚊魚作為研究對象，通過室內暴露實驗來研究水體中存在的低濃度BaP和Cd2+暴露對成年雄性食蚊魚的求偶行為的影響。同時進行了成年雌性食蚊魚的暴露實驗，研究經(jīng)暴露后其對成年雄魚向雌魚求偶行為所產(chǎn)生的影響，從而了解水環(huán)境中BaP、Cd2+污染對食蚊魚個體生殖行為的負面生物效應，探討B(tài)aP、Cd2+對魚類是否具有類雌激素效應，分析BaP和其對魚類繁殖內分泌生理過程的干擾而導致其生殖行為上的變化，其研究成果將為水環(huán)境污染的保護與恢復工作提供有價值的數(shù)據(jù)和資料。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

BaP試劑，CdCl2試劑。由于B［a］P在水中的溶解度極低，因此使用高純度的二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，99.8%，sigma)作為助溶劑配制成保存液。DMSO在預實驗中已證明其對實驗結果沒有產(chǎn)生明顯的影響。

1.2 實驗動物

食蚊魚購自廣州市花鳥魚蟲市場，室內馴養(yǎng)1個月，馴養(yǎng)期間每日喂食紅蟲2次，每3 d換水1/3，及時清除沉積物。隨機挑選馴養(yǎng)后體長相近的性成熟雄(♂)、雌(♀)魚各45尾(性成熟♂、♀鑒別:將雄魚放入冰水混合液中使其麻痹，在解剖鏡下觀察其生殖鰭末端具有鉤狀結構即為成年雄魚;雌魚個體較大，均沒有生殖鰭的結構，挑選具有胎斑的為懷妊個體，屬性成熟的雌魚，圖1-1)。雄魚平均體長26 mm，雌魚體長35～43 mm。

1.3 實驗方法

1.3.1 BaP和Cd2+暴露實驗設置

BaP暴露:設定0.1和100 μg/L濃度暴露組，另設濃度為0的對照組，每組雄魚與雌魚各15尾，分別放入3個15L的40 cm×25 cm×30 cm的玻璃魚缸中。暴露期間水溫保持在26℃，每日喂食紅蟲兩次，每2 d換水一次，保持溶液所設置的暴露濃度不變，并保持缸中水是流動循環(huán)的。BaP暴露分別于2010年6月18日—7月30日(持續(xù)暴露6周)和2010年6月18日—8月13日(持續(xù)暴露8周)。

圖1 食蚊魚3種求偶行為Fig 1 3 kinds of courtship behavior of mosquitofish

Cd2+暴露:設定5和500 nmol/L濃度暴露組，另設濃度為0的對照組，每組雄魚與雌魚各15尾，分別放入3個15L的40 cm×25 cm×30 cm的塑料魚缸中。暴露期間保持溫度在26℃，每日喂食紅蟲兩次，每2 d換水一次，保持溶液所設置的暴露濃度不變，并保持缸中水是流動循環(huán)的。Cd2+暴露分別于2010年6月27日—8月8日(持續(xù)暴露6周)和2010年6月18日—8月22日(持續(xù)暴露8周)。

1.3.2 食蚊魚配對求偶行為實驗分組

分別從暴露BaP和Cd2+6周后不同濃度組和對照組中隨機挑選健康雄魚和腹部帶有孕斑黑點的雌魚進行實驗。分別將各組雌、雄魚分開置于裝有15L清水的魚缸中適應1 d時間。暴露8周的BaP和Cd2+組的食蚊魚也按上述方法先進行處理。食蚊魚配對求偶行為的實驗分組見表1和表2，每組至少觀察5對(n=5)，最高達9對(n=9)。分別記錄暴露6周和8周后食蚊魚的求偶行為。

對食蚊魚3種求偶行為的觀察時間共3 d，每天從上午8點至12點進行。將已分開的雌、雄個體按照觀察分組的設定，各隨機選取1♂：1♀配對放入同一魚缸中?；旌? min后開始用JVC錄像機進行錄像，每對錄像時間是10 min。每組進行3次錄像，錄像完畢后，將食蚊魚放入原來暴露時期的魚缸中。同時分別進行重復實驗。

表1 食蚊魚BaP和Cd2+暴露6周實驗分組Table 1 Experimental groups of mosquitofish exposed to BaP and Cd2+for 6 weeks

表2 食蚊魚BaP和Cd2+暴露8周實驗分組Table 2 Experimental groups of mosquitofish exposed to BaP and Cd2+for 8 weeks

將記錄的數(shù)據(jù)通過SPSS17.0及Excel計算均值和標準差。除此之外，還進行單因素方差(ANOVA)分析的方差齊性檢驗分析總體樣本方差的差異性，當P＜0.05時，認為差異顯著，再用獨立樣本T檢驗每兩組間的差異性。所有數(shù)據(jù)和圖表均以平均值±標準差的方式表示。

2 結果

2.1 雄魚BaP暴露后對其求偶行為的影響

如圖2-A所示，經(jīng)BaP暴露6周后雄魚對雌魚其3種求偶行為平均次數(shù)均減少，且隨著暴露濃度的增加而依次降低。實驗組1(BaP 0.1 μg/L)和實驗組2(BaP 100 μg/L)與對照組相比，在交配次數(shù)上明顯低于對照組(P＜0.01)。實驗組2在靠近行為次數(shù)上較對照組減少明顯(P＜0.05)。BaP暴露6周后食蚊魚的追尾行為次數(shù)雖然有所下降，但與對照組比較并沒有較大差異(p＞0.05)。

1.3.3 錄像分析

通過錄像統(tǒng)計食蚊魚3種求偶行為的次數(shù)，包括:1)靠近行為;2)交配行為;3)追尾行為。食蚊魚的繁殖行為曾有報道［6］，結合本研究的觀察，本文也將雄魚繁殖行為區(qū)分為3種方式:靠近行為(圖1-2)、交配行為(圖1-3，1-4，1-5，1-6)和追尾行為(圖1-7，1-8)。當雄魚表現(xiàn)為靠近行為時，它會跟在雌魚后面游動，頭部正對著雌魚的生殖口。交配通常是雄魚生殖鰭強行插入雌魚生殖孔。在這個過程中，雄魚從后方靠近雌魚，用力把生殖鰭插入雌魚的生殖管里［7］。而追尾行為是靠近行為里的一種，這時雄魚會緊挨著雌魚的生殖口并且快速跟隨雌魚游動。本文詳細記錄其觀察結果，以上的3種求偶行為在錄像中可以清楚地分辨出來。

1.3.4 統(tǒng)計數(shù)據(jù)

圖2 BaP暴露雄、雌魚6周或8周后其對雄魚求偶行為(次數(shù)/小時)的影響Fig 2 Effects on the courtship behavior frequency of male mosquitofish exposed to BaP after 6 and 8 weeks

如圖2-B所示，實驗組7雄魚暴露在BaP 0.1 μg/L 8周后其較對照組雄魚對雌魚的3種求偶行為平均次數(shù)下降，其中靠近次數(shù)遠少于對照組，兩組間在靠近次數(shù)上差異非常顯著(P＜0.01)。表明雄魚在低濃度BaP暴露8周后其求偶行為，尤其是靠近行為受到影響明顯且次數(shù)降低。

2.2 雌魚BaP暴露后對雄魚向其求偶行為的影響

如圖2-C所示，實驗組3雌魚經(jīng)BaP 0.1 μg/L暴露6周后，雄魚向其靠近和交配行為平均次數(shù)比對照組中有所減少，追尾行為次數(shù)則略有上升。而實驗組4雌魚經(jīng)BaP 100 μg/L暴露6周后，雄魚除了靠近行為平均次數(shù)增多，其他兩種求偶行為次數(shù)與對照組相近。對照組與實驗組3和實驗組4在求偶行為次數(shù)上分別沒有明顯差異(P＞0.05)，表明雌魚暴露BaP后對雄魚向其求偶的行為不會產(chǎn)生明顯影響。

如圖2-D所示，實驗組8雌魚經(jīng)BaP 0.1 μg/L暴露8周后，雄魚向其的求偶行為中靠近與交配行為平均次數(shù)低于對照組，追尾平均次數(shù)則維持相同水平。實驗組9雌魚經(jīng)BaP 100 μg/L暴露8周后，雄魚向其的求偶行為中除了靠近平均次數(shù)略微下降外，交配與追尾的平均次數(shù)都比對照組有所上升。對照組與實驗組8和實驗組9之間雖然分別沒有顯著性差異(P＞0.05)，但仍可見雌魚在低BaP濃度(0.1 μg/L)中暴露8周后，雄魚對其的求偶行為次數(shù)有所減少;而雌魚在高濃度BaP(100 μg/L)暴露8周后，雄魚對其求偶行為次數(shù)都呈升高的趨勢。

2.3 雌、雄魚BaP同時暴露后對雄魚向雌魚求偶行為的影響

如圖2-E所示，觀察了實驗組5和實驗組6雌、雄魚分別同時暴露在BaP濃度分別為0.1和100 μg/L的每對食蚊魚的求偶行為?？梢?，實驗組5雄魚向雌魚求偶行為平均次數(shù)比實驗組6的次數(shù)多，兩組在交配平均次數(shù)上存在著極為明顯的差別，實驗組6的交配平均次數(shù)為0，即在高濃度100 μg/L的BaP暴露6周后的雌魚對雄魚的交配行為起到了阻礙的作用。

2.4 雄魚Cd2+暴露后對其求偶行為的影響

由圖3-A可見，實驗組1雄魚經(jīng)Cd2+5 nmol/L暴露6周后其對雌魚3種求偶行為平均次數(shù)低于對照組次數(shù)。實驗組2雄魚經(jīng)Cd2+500 nmol/L暴露6周后對雌魚其靠近和交配平均次數(shù)比對照組少，但追尾平均次數(shù)有所增加，同時實驗組2雄魚的3種求偶行為平均次數(shù)也比實驗組1有所增加。但對照組與實驗組1和實驗組2之間的3種求偶行為分別都沒有顯著差異(P＞0.05)。表明在5和500 nmol/L的Cd2+中暴露6周后的雄魚，它的求偶行為沒有因為Cd2+暴露而受到較大的影響。

圖3-B所示，實驗組7雄魚暴露在Cd2+5 nmol/L和實驗組8雄魚暴露在Cd2+500 nmol/L 8周后分別與對照組比較，3種求偶行為平均次數(shù)存在顯著差異(P＜0.05)，其中交配平均次數(shù)存在極顯著差異(P＜0.01)。求偶行為次數(shù)隨著暴露Cd2+濃度的增加而下降，暴露8周Cd2+后的雄魚其求偶行為受到較大影響而減少。

圖3 Cd2+暴露雄、雌魚6周或8周后其對雄魚求偶行為(平均次數(shù)/小時)的影響。Fig 3 Effects on the courtship behavior frequency of male mosquitofish exposed to Cd2+after 6 and 8 weeks

2.5 雌魚Cd2+暴露后對雄魚向其求偶行為的影響

由圖3-C所示，實驗組3雌魚暴露在Cd2+5 nmol/L 6周后，與對照組相比，雄魚對其的3種求偶行為平均次數(shù)相近;而實驗組4雌魚暴露在Cd2+500 nmol/L 6周后與對照組相比，雄魚對其的3種行為次數(shù)均有所增加。但是對照組與實驗組3和實驗組4分別對照，其差異都不顯著(P＞0.05)，表明雌性食蚊魚暴露在Cd2+中，并不影響雄魚對其求偶行為。

圖3-D所示，實驗組9雌魚暴露在Cd2+5 nmol/L和實驗組10雌魚暴露在Cd2+500 nmol/L 8周后，與對照組相比，雄魚對其的靠近平均次數(shù)較對照組減少，交配平均次數(shù)保持穩(wěn)定，追尾平均次數(shù)在實驗組9略為上升，實驗組10稍微下降，但均比對照組高。實驗組9和實驗組10雄魚的求偶行為平均次數(shù)與對照組不存在顯著差異(P＞0.05)，說明分別暴露在濃度為5 nmol/L和500 nmol/L的Cd2+中的雌魚對雄魚求偶行為影響不大。

2.6 雌、雄魚Cd2+同時暴露后對雄魚向雌魚求偶行為的影響

圖3-E所示，與對照組相比較，實驗組5雌雄魚同時暴露在5 nmol/L Cd2+中，其雄魚向雌魚求偶的行為平均次數(shù)少于實驗組6雌雄魚同時暴露在500 nmol/L Cd2+的次數(shù)。尤其是在交配行為次數(shù)上，分別暴露在Cd2+濃度為500 nmol/L的雌雄魚是暴露在5 nmol/L Cd2+濃度的雌雄魚的約4倍，但是與對照組相比，這兩實驗組雄魚向雌魚求偶的3種行為分別都沒有顯著差異(P＞0.05)，表明雌雄魚都暴露在這兩種濃度的Cd2+時，他們的求偶行為次數(shù)不會因為暴露濃度不同而產(chǎn)生明顯差異。

圖3-F可知，雌雄魚都在Cd2+中暴露8周后，實驗組11(Cd2+5 nmol/L)的食蚊魚的求偶行為平均次數(shù)明顯高于實驗組12(Cd2+500 nmol/L)的食蚊魚，尤其在靠近平均次數(shù)上兩組間存在極為明顯差別(P＜0.01)。雌雄魚在Cd2+500 nmol/L暴露8周后比在Cd2+5 nmol/L暴露時雄性食蚊魚在靠近雌魚行為上有明顯減少，但其他兩種行為沒有太大變化，表明實驗組12雄魚的靠近行為是因為暴露濃度較高而受到顯著影響，其下降明顯。

3 討論

3.1 BaP暴露對雄性食蚊魚求偶行為的影響

雄魚暴露在BaP中對其求偶行為影響很大，且隨著暴露濃度增加與暴露時間的延長，其求偶行為與對照組的雄魚相比呈下降趨勢?？拷袨樵谇笈贾邢扔谧肺残袨槌霈F(xiàn)［11］。一般來說，雄魚會嘗試多次交配，但是只有很少的一部分交配行為能夠成功將精子轉移到雌魚體內［12］。通過BaP暴露各組實驗可知，這3種求偶行為平均次數(shù)依次是:靠近行為＞交配行為＞追尾行為。在較低濃度(0.1 μg/L)就已經(jīng)對雄魚交配行為有明顯抑制作用，在較高濃度(100 μg/L)中雄魚的靠近行為也開始顯著下降。也就是說在0.1 μg/L的BaP暴露6周后的雄性食蚊魚的求偶行為已經(jīng)受到抑制作用。食蚊魚求偶行為與魚體內的睪酮濃度水平相關性表明，求偶行為至少有部分是受到雄激素的的控制［11］。有研究表明，雄性激素在魚類和其他脊椎動物的求偶行為中有重要作用［11］。雄魚的求偶行為會因為去除了生殖腺而受到干擾或消失，求偶行為也可在雄性激素調節(jié)下恢復［11］。由于BaP主要影響動物的雄激素分泌系統(tǒng)，且暴露BaP后的雄魚求偶行為的減少，推測BaP可能減少雄魚體內雄激素的分泌水平，從而在一定程度上降低了雄魚的求偶行為。雄魚求偶行為的減少會使得雌魚懷孕的機率也隨之減少。

本實驗中，雌魚暴露在BaP中對雄魚的求偶行為與對照組的求偶行為沒有顯著差異，但是無論暴露時間是6周還是8周，在較低濃度一組(0.1 μg/L)，雄魚對其3種求偶行為有不同程度地減少，而在較高濃度一組(100 μg/L)，雄魚對其求偶行為次數(shù)比前者有所增加。推斷，雌魚無論暴露在高濃度或低濃度的BaP時，對雌魚雌激素的分泌都沒有產(chǎn)生明顯的作用，低濃度中的求偶行為減少或高濃度中的求偶行為有所提高，有可能是由于受到樣本個體間差異的影響所致。懷孕的雌魚在腹部有一個明顯的妊娠黑點(孕斑)，它會隨著懷孕的過程逐漸擴大［12］。Peden證實雌魚的生殖口附近的妊娠黑點能夠在求偶過程中吸引雄魚［13］。在本實驗過程中發(fā)現(xiàn)，雄魚對妊娠黑點較大的雌魚求偶行為次數(shù)比雌魚腹部黑點較小的多，原因可能是除了BaP能夠提高雌激素分泌外，雌魚的雌激素分泌本身會隨著懷孕的過程而增加，從而對雄魚的吸引加強。但是本文發(fā)現(xiàn)，妊娠黑點的大小不會對雄魚求偶行為產(chǎn)生較大的影響(P＞0.05)。

將雄魚與雌魚同時暴露在濃度為100 μg/L的BaP中6周，雄魚的求偶行為比暴露同樣時間濃度為0.1 μg/L的要低很多，其中暴露100 μg/L的食蚊魚交配平均次數(shù)為0，表明將雄魚和雌魚同時暴露在較高濃度的BaP中，雄魚的求偶行為受到顯著抑制。原因是由于高濃度BaP對雄激素水平的干擾，使得與之相關的求偶行為也受到了一定程度影響，特別是交配行為幾乎不出現(xiàn)。在BaP暴露8周后，濃度為100 μg/L組中雄魚全部死亡，導致本實驗設置8周后100 μg/L組的缺失，也說明暴露在較高濃度的BaP(100 μg/L)8周后，還會對雄魚有嚴重的致死效應。此外本實驗結果還表明，水溫與食蚊魚的求偶行為也有密切相關，本文發(fā)現(xiàn)，暴露實驗持續(xù)至8周雄魚的3種求偶行為都比6周的要高。原因應該是與水溫升高有關。有文獻指出，溫度和日照是調節(jié)硬骨魚類年繁殖周期的基本環(huán)境影響因素。雌性食蚊魚在春季開始繁殖活動是與水溫逐漸升高有關，而繁殖期的的結束是由日照長度變短引起的［14］。

3.2 Cd2+暴露對食蚊魚求偶行為的影響

暴露于Cd2+各組實驗可見，雄魚3種求偶行為平均次數(shù)依次是:靠近行為＞交配行為＞追尾行為。雄魚暴露在Cd2+中6周后，在低濃度(5 nmol/L)的求偶行為均比對照組減少，而高濃度(500 nmol/L)求偶行為則有所上升。但對照組與實驗組間不存在顯著差異性說明可能是由于個體存在的差異導致。而暴露在Cd2+8周后，無論是低濃度組還是高濃度組與對照組比較都出現(xiàn)極為顯著的差異，可能是暴露8周后，Cd2+對雄魚求偶行為的抑制作用才變得十分明顯。有研究表明Cd2+具有雌激素活性，也被稱為環(huán)境雌激素，長期暴露下可能會擾亂雄魚的雄性激素分泌，導致雄魚求偶行為減少［15］。

雌魚暴露在低濃度(5 nmol/L)Cd2+中6周和8周后，對雄魚求偶行為產(chǎn)生影響很小。而暴露在高濃度(500 nmol/L)6周和8周后則能提高雄魚對其的求偶行為，雖然暴露6周及8周的求偶行為與對照組沒有差異，但由于Cd2+能夠影響雌激素分泌系統(tǒng)，所以可能在高濃度下對雌魚的雌激素分泌會有促進作用。將雄魚和雌魚暴露在高濃度(500 nmol/L)的Cd2+中，求偶行為都比低濃度(5 nmol/L)有所上升，尤其表現(xiàn)在交配次數(shù)上。但是暴露6周的兩組間沒有顯著差異，可能是因為在Cd2+中暴露6周的雄魚及雌魚，他們的性激素分泌系統(tǒng)沒有受到明顯影響，只是個體間存在的差異所致。但是暴露8周后，高濃度的求偶行為都比低濃度的要低得多，且在靠近行為上有顯著差異?？赡苁且驗楸┞稌r間增加后，Cd2+對食蚊魚的性激素分泌系統(tǒng)的影響表現(xiàn)明顯。雖然暴露在高濃度8周可能促使雌魚的雌激素分泌增加，但是此時雄魚的雄激素分泌受到嚴重干擾，所以最終雄魚與雌魚均暴露在高濃度8周后，它們的求偶行為下降明顯。

4 結論

雄性食蚊魚暴露在BaP及Cd2+中，其求偶行為隨著暴露濃度的升高和暴露時間的延長而呈現(xiàn)下降趨勢。雌性食蚊魚暴露在BaP及Cd2+中，不影響雄魚對其求偶行為。水體中的BaP及Cd2+主要影響雄性食蚊魚的求偶行為，推測這與BaP及Cd2+會明顯地影響雄魚體內雄激素分泌水平有關。

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