樹(shù)舌熒光多糖的制備及其在人大腸癌細(xì)胞SWWC1116中的定位

蘇 玲, 李雨婷, 王再林, 宋 慧, 杜 金, 吳宗翰， 張中北

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 長(zhǎng)春 130118)

糖類物質(zhì)與蛋白質(zhì)和核酸均為參與生命活動(dòng)的生物大分子, 不僅提供能量物質(zhì)(如糖原和淀粉)與細(xì)胞內(nèi)的支撐物(如纖維素和果膠)[1], 還參與介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生, 影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、 分裂、 分化及細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[2]. 由于多糖分子極性大, 利用氣相色譜和核磁共振等不易直接對(duì)其進(jìn)行測(cè)定； 且自身無(wú)發(fā)光基團(tuán), 不能采用紫外吸收光譜和熒光吸收光譜進(jìn)行檢測(cè)； 并受生物體自身內(nèi)源性多糖的干擾, 因此多糖在生物體內(nèi)代謝、 細(xì)胞中定位以及與細(xì)胞的識(shí)別位點(diǎn)等方面的研究較少. 文獻(xiàn)[3-4]對(duì)多糖進(jìn)行了熒光標(biāo)記; 文獻(xiàn)[5]對(duì)樹(shù)舌(Ganodermaapplanatum)多糖進(jìn)行了研究. 本文選擇已被證實(shí)具有抗腫瘤和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能[6-7]的工廠化生產(chǎn)的樹(shù)舌靈芝液體深層發(fā)酵浸膏多糖作為實(shí)驗(yàn)材料, 將其進(jìn)行熒光標(biāo)記, 旨在示蹤樹(shù)舌多糖在細(xì)胞中的定位, 為進(jìn)一步探索其生物活性的作用機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樹(shù)舌液體深層發(fā)酵浸膏水提多糖(GAP)由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生化研究室制得(由相對(duì)分子量分別為4 600,6 600,30 000的3個(gè)均一組分組成, 由葡萄糖、 甘露糖、 巖藻糖、 半乳糖和葡萄糖醛酸等單糖組成); 人大腸癌SWWC1116細(xì)胞購(gòu)自吉林省腫瘤研究所; 酪胺和硼氰化鈉(美國(guó)Aladdin公司); 異硫氰酸熒光素FITC(美國(guó)Sigma公司); RPMI1640(美國(guó)Gibco公司); 新生牛血清(蘭州民海生物技術(shù)有限公司); 其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

BD型流式細(xì)胞儀(美國(guó)FACS公司); 一體化數(shù)碼熒光顯微鏡(深圳博宇顯微儀器廠); TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司); 970CRT熒光分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限責(zé)任公司); 8400紅外光譜儀(日本島津公司); DG5032酶標(biāo)儀(南京華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司); xCELLigence RTCA DP全自動(dòng)實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀(美國(guó)Roche公司); VS-840-1超凈工作臺(tái)(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠); Cell240 CO2恒溫培養(yǎng)箱(德國(guó)賀利氏公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 GAP的熒光標(biāo)記 參考文獻(xiàn)[8], 對(duì)GAP的還原性末端選擇性連接熒光基團(tuán)(FITC). 稱取200 mg GAP, 充分溶解于7.5 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH=8.0)后, 加入200 mg酪胺和75 mg硼氰化鈉, 于37 ℃反應(yīng)96 h, 間或震蕩, 離心收集上清液, 取500 μL上清液過(guò)Sephadex G25層析柱(16 mm×20 cm), 蒸餾水洗脫(0.3 mL/min), 收集洗脫液, 測(cè)定每管糖含量及紫外吸光值, 繪制胺化多糖(Try-GAP)洗脫曲線. 收集Try-GAP, 紫外分光光度計(jì)在190～500 nm掃描, 根據(jù)紫外吸收峰值的變化判斷胺化反應(yīng)是否成功. Try-GAP與FITC避光室溫反應(yīng)過(guò)夜, 反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇反復(fù)沉淀, 所得沉淀經(jīng)Sephadex G25凝膠柱層析純化, 測(cè)定每管糖含量及熒光吸光值, 繪制熒光多糖(FITC-GAP)洗脫曲線.

1.2.2 紅外光譜掃描 分別稱取1 mg GAP、 Tyr-GAP及FITC-GAP與KBr混勻壓片, 紅外光譜儀在4 000～400 cm-1掃描.

1.2.3 熒光取代度測(cè)定 參考文獻(xiàn)[9], 將FITC配制成1 μg/mL溶液. 取5支錫箔包裹的試管, 分別加入FITC溶液0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 mL, 蒸餾水定容至5.0 mL, 混勻. 以蒸餾水為空白對(duì)照, 用熒光分光光度計(jì)(激發(fā)波長(zhǎng)488 nm, 發(fā)射波長(zhǎng)530 nm, 狹縫寬10 nm)測(cè)定各管的熒光強(qiáng)度(A). 以FITC質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo), 熒光強(qiáng)度(A)為縱坐標(biāo), 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 并計(jì)算回歸方程. 稱取2 mg的FITC-GAP, 蒸餾水定容至10 mL, 取1 mL樣品溶液, 加入3 mL蒸餾水混勻后, 檢測(cè)熒光強(qiáng)度(A), 并將其代入回歸方程, 計(jì)算GAP的熒光標(biāo)記效率.

1.2.4 生物活性穩(wěn)定性 使用含體積分?jǐn)?shù)為10%的熱滅活新生牛血清RPMI1640完全培養(yǎng)液, 在體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中37 ℃貼壁培養(yǎng)人大腸癌細(xì)胞SWWC1116. 每2 d用體積分?jǐn)?shù)為0.25%的胰蛋白酶消化傳代1次. 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人大腸癌細(xì)胞SWWC1116按每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于E-Plate多孔培養(yǎng)板中, 將其置于Xcelligence RTCA DP細(xì)胞分析儀中, 于37 ℃培養(yǎng)24 h, 每15 min檢測(cè)細(xì)胞指數(shù)1次, 棄去培養(yǎng)液, 分別加入含有質(zhì)量濃度為1,2,3,4,5 mg/mL GAP和FITC-GAP的RPMI1640完全培養(yǎng)液, 再用全自動(dòng)實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀監(jiān)測(cè)加藥48 h內(nèi)各處理組細(xì)胞指數(shù)的變化.

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)大腸癌細(xì)胞SWWC1116中的熒光信號(hào) 將人大腸癌細(xì)胞SWWC1116接種于RPMI1640完全培養(yǎng)液中, 在體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中37 ℃貼壁培養(yǎng), 每2 d胰酶消化傳代, 細(xì)胞計(jì)數(shù), 在6孔板中每孔接種5×105個(gè)細(xì)胞, 24 h后, 設(shè)立9個(gè)實(shí)驗(yàn)組, 每組分別加入含質(zhì)量濃度為20,100,500 μg/mL的FITC-GAP培養(yǎng)液2 mL, 孵育4,8,12 h, 并以無(wú)FITC-GAP培養(yǎng)液2 mL為空白對(duì)照組. 收集各組細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液, 洗滌, 固定, 每組按每毫升1×106個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù), 取1 mL細(xì)胞懸液, 進(jìn)行流式分析.

1.2.6 熒光顯微鏡觀察FITC-GAP在人大腸癌細(xì)胞SWWC1116中的定位 將人大腸癌細(xì)胞SWWC1116接種于RPMI1640完全培養(yǎng)液中, 在體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中37 ℃貼壁培養(yǎng), 每2 d 胰酶消化傳代, 細(xì)胞計(jì)數(shù). 按每孔5×105個(gè)細(xì)胞接種于放有蓋玻片的6孔板中, 培養(yǎng)24 h, 吸去培養(yǎng)液, 設(shè)立4個(gè)實(shí)驗(yàn)組, 每組加入含質(zhì)量濃度100 μg/mL的FITC-GAP的培養(yǎng)液2 mL, 分別孵育2,4,8,12 h. 取出蓋玻片, 洗滌, 固定, 熒光顯微鏡觀察拍照.

2 結(jié)果與討論

2.1 GAP熒光標(biāo)記結(jié)果

多糖胺化還原后的洗脫曲線和紫外掃描曲線分別如圖1～圖4所示. 由圖1～圖4可見(jiàn), 糖峰(490 nm)與蛋白峰(280 nm)重合, Tyr-GAP和GAP在λ=280 nm的光吸收值分別為0.076和0.045. Tyr-GAP經(jīng)FITC親核加成后, 洗脫曲線的糖峰(490 nm)與FITC熒光峰(450 nm)重合, 表明多糖被熒光標(biāo)記.

圖1 Tyr-GAP洗脫曲線Fig.1 Elution curves of Tyr-GAP

圖2 FITC-GAP洗脫曲線Fig.2 Elution curves of FITC-GAP

圖3 GAP紫外掃描曲線Fig.3 UV curve of GAP

圖4 Try-GAP紫外掃描曲線Fig.4 UV curve of Tyr-GAP

圖5 FITC的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve of FITC

2.2 紅外光譜檢測(cè)結(jié)果

2.3 熒光取代度結(jié)果

圖5為FITC的標(biāo)準(zhǔn)曲線. 由圖5可見(jiàn), FITC-GAP的熒光強(qiáng)度為34.871, 將其代入回歸方程y=178.1x+14.83(R2=0.992), 可得FITC-GAP的熒光標(biāo)記效率為0.90%. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 熒光標(biāo)記后每100 μg GAP中含有0.9 μg FITC.

2.4 細(xì)胞毒活性

GAP標(biāo)記前后的細(xì)胞毒活性如圖6所示, 其中橫坐標(biāo)表示時(shí)間, 縱坐標(biāo)表示細(xì)胞指數(shù), GAP反映貼壁細(xì)胞大小、 細(xì)胞數(shù)量、 細(xì)胞貼附面積和貼附的緊密程度等細(xì)胞整體狀態(tài), 細(xì)胞指數(shù)隨貼壁細(xì)胞的增多、 貼壁后面積的增大和貼附緊密程度的增加而變大. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, GAP標(biāo)記FITC后, 對(duì)人大腸癌細(xì)胞SWWC1116的細(xì)胞毒性與標(biāo)記前基本一致, 即熒光標(biāo)記后并未影響GAP的生物活性, 保證了GAP的生物學(xué)穩(wěn)定性.

圖6 GAP(A)和FITC-GAP(B)的細(xì)胞毒活性Fig.6 Cytotoxin activities of GAP (A) and FITC-GAP (B)

2.5 FITC-GAP在人大腸癌細(xì)胞SWWC1116中的定位

SWWC1116細(xì)胞的熒光信號(hào)如圖7所示. 由圖7可見(jiàn): 各實(shí)驗(yàn)組均檢測(cè)到FITC-GAP的熒光信號(hào); 在相同的孵育時(shí)間下, 細(xì)胞上的熒光強(qiáng)度和被標(biāo)記細(xì)胞數(shù)隨加入FITC-GAP質(zhì)量濃度的降低而下降； 當(dāng)FITC-GAP的質(zhì)量濃度為100,20 μg/mL時(shí), 隨孵育時(shí)間的延長(zhǎng), 熒光強(qiáng)度和被標(biāo)記細(xì)胞數(shù)升高; 當(dāng)FITC-GAP的質(zhì)量濃度為500 μg/mL時(shí), 熒光強(qiáng)度和被標(biāo)記細(xì)胞數(shù)隨孵育時(shí)間的改變不明顯. 表明GAP可與人大腸癌細(xì)胞SWWC1116結(jié)合, 并受孵育時(shí)間及GAP加入質(zhì)量濃度的影響.

圖7 SWWC1116細(xì)胞的熒光信號(hào)Fig.7 Fluorescence intensity of SWWC1116

2.6 熒光顯微鏡觀察FITC-GAP在人大腸癌細(xì)胞SWWC1116中的定位

SWWC1116細(xì)胞的熒光顯微照片如圖8所示. 由圖8可見(jiàn), 當(dāng)FITC-GAP與靶細(xì)胞SWWC1116作用2 h時(shí), 細(xì)胞膜上有少量熒光發(fā)光. 當(dāng)孵育時(shí)間分別為4,8,12 h時(shí), 細(xì)胞膜上及細(xì)胞核內(nèi)均檢測(cè)到熒光信號(hào). 表明GAP可與人大腸癌細(xì)胞SWWC1116的細(xì)胞膜結(jié)合, 并可轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi).

圖8 SWWC1116細(xì)胞的熒光顯微照片F(xiàn)ig.8 Fluorescent microscopic pictures of SWWC1116

綜上, 本文通過(guò)對(duì)GAP的半縮醛基上引入熒光基團(tuán)FITC, 使GAP“可視化”, 發(fā)現(xiàn)GAP可與人大腸癌細(xì)胞SWWC1116的細(xì)胞膜結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核, 表明GAP在SWWC1116細(xì)胞表面的特異性位點(diǎn)通過(guò)載體轉(zhuǎn)運(yùn)或細(xì)胞胞吞等方式進(jìn)入胞內(nèi).

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