羊傳染性膿皰病毒吉林分離株F1L基因的克隆與同源性分析

邵洪澤,程榮華,石春軍,呼延含蓉,黃海楠,許 堯,毛文智,胡桂學

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院,長春 130118；2. 吉林省畜牧獸醫(yī)科學研究院,長春 130062；3. 前郭縣動物疫病預防控制中心,吉林 松原 131100)

羊傳染性膿皰病毒是痘病毒科副痘病毒屬的雙股DNA病毒,主要危害3～6月齡羔羊,易引起急性、 高度接觸性、 嗜皮性的人獸共患病----羊傳染性膿皰病. 該病毒通過直接接觸傳染,在感染動物的口腔、 唇、 舌、 鼻孔周圍、 乳房等部位的皮膚與黏膜形成丘疹、 膿皰、 潰瘍和疣狀痂皮[1]， 常呈群發(fā)性流行,如吉林省主要養(yǎng)羊區(qū)的發(fā)病率為10%～20%,最高為80%,病死率約為10%[2],對人獸健康均構(gòu)成嚴重威脅[3-4].

羊傳染性膿皰病毒的基因組中部區(qū)域(ORFs009-111)較保守,主要包括與病毒在細胞中復制和病毒粒子在細胞漿中裝配成熟的相關(guān)基因[5],與痘病毒相關(guān)基因的同源性較高,具有較多同源性蛋白質(zhì). 其中F1L基因(ORF059)長為1 011 bp,編碼39 000蛋白,該基因位于病毒基因組物理圖譜的中央,是一個完整的開放閱讀框高度保守. 39 000蛋白在病毒成熟過程中作用較大[6]， 是病毒主要的肝素結(jié)合蛋白,具有肝素結(jié)合活性[7],可與大多數(shù)哺乳動物細胞表面表達的硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)受體結(jié)合,因此該蛋白在病毒吸附和侵入過程中作用較大. 在可溶性肝素存在的條件下,F1L蛋白將與GAGs結(jié)合,從而影響病毒吸附宿主,抑制病毒感染[8]. Gallina等[9]研究表明,F1L編碼蛋白能刺激機體中和抗體的產(chǎn)生,并誘導體液與細胞介導的免疫應(yīng)答. 此外,F1L基因可作為目的基因用于體外重組表達39 000蛋白,為ORFV亞單位疫苗的研制提供標準抗原. 本文選擇表達該蛋白的F1L為目的基因,并研究其同源性,將有利于選擇不同毒株間保守的免疫原基因作為新型疫苗研制的目的基因,為新型疫苗的研制提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 病毒與菌株

羊傳染性膿皰病毒JLSY04株,由吉林省畜牧獸醫(yī)科學研究院分離、 凍干保存；E.coli感受態(tài)細胞JM109由吉林省畜牧獸醫(yī)科學研究院提供， 于-70 ℃保存.

1.2 細 胞

無菌采取健康犢牛睪丸,按文獻[10]方法消化,制作犢牛睪丸細胞.

1.3 試 劑

Mini BEST病毒DNA提取試劑盒購自日本Takara公司；DL2 000 DNA Marker購自北京鼎國生物工程有限公司；2×GC緩沖溶液Ⅰ(加Mg2+)， dNTP 混合液(2.5 mmol)，PfuDNA聚合酶41.675 nkat/μL， pMD18-T載體， 凝膠回收試劑盒， 小量質(zhì)粒提取試劑盒， 限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ和MEM購自大連寶生物工程有限公司.

1.4 F1L基因的克隆

1.4.1 病毒的培養(yǎng) 將病毒1MOI接種于生長良好、 已長成單層的牛睪丸細胞內(nèi),37 ℃孵育1 h后,用維持液繼續(xù)培養(yǎng),觀察細胞變化. 待細胞病變70%～80%時,收毒,反復凍融3次,-70 ℃保存?zhèn)溆?

1.4.2 病毒DNA的提取及PCR擴增 用Mini BEST病毒DNA 提取試劑盒提取病毒基因組DNA,按照試劑盒說明書操作. 用分光光度計檢測提取的病毒基因組DNA,-70 ℃保存?zhèn)溆?

1.5 F1L基因的序列測定

使用凝膠回收試劑盒回收目的片段,由于PfuDNA聚合酶擴增的PCR產(chǎn)物為平端,因此要將純化后的PCR產(chǎn)物加poly A尾才能連接到T載體. 取1～7 μL純化的PCR產(chǎn)物,加10×TaqDNA聚合酶緩沖液(含有MgCl2)1 μL,終濃度為0.2 mmol/L的dATP,TaqDNA聚合酶1 μL,再加蒸餾水至10 μL,70 ℃反應(yīng)15～30 min. 取1～2 μL與pMD18-T載體連接,轉(zhuǎn)化至E.coli感受態(tài)細胞JM109中,涂布平板,37 ℃過夜培養(yǎng). 挑菌,用小量提取質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒,進行PCR鑒定的同時用Hind Ⅲ和EcoRⅠ進行酶切鑒定,隨機挑選2個鑒定正確的菌由大連寶生物工程有限公司測序.

1.6 序列分析

用DNAstar軟件將所測序列與GenBank中具代表性的相應(yīng)片段序列進行同源性比較(表1),得到系統(tǒng)進化樹,并比較核苷酸和氨基酸的同源性.

表1 病毒毒株序列比較Table 1 Strain names of the viruses

2 結(jié) 果

2.1 細胞病變(CPE)

單層牛睪丸細胞接種病毒18～24 h后變圓、 腫脹,細胞間質(zhì)增寬,松散并開始聚集,呈葡萄串狀,如圖1所示. 由圖1可見,接種病毒約24 h后呈現(xiàn)明顯的細胞病變.

(A) 正常牛睪丸細胞 (B) 呈葡萄狀細胞病變圖1 病毒在ST細胞上形成CPEFig.1 CPE formation of virus on the ST cells

2.2 病毒DNA提取及PCR擴增結(jié)果

采用分光光度計測得樣品羊傳染性膿皰病毒基因組DNA的質(zhì)量濃度為50 μg/mL. 以提取的羊傳染性膿皰病毒JLSY04株基因組DNA為模板,進行PCR擴增反應(yīng),擴增的目的片段約為1 000 bp,與預期片段長度相符,如圖2所示.

2.3 陽性質(zhì)粒鑒定結(jié)果

將連接pMD18-T載體的陽性質(zhì)粒分別用PCR擴增鑒定,同時用Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ進行酶切鑒定,均得到約1 000 bp的目的片段,與預期片段長度相符,結(jié)果分別如圖3和圖4所示.

2.4 序列測定結(jié)果及同源性分析

所得序列如下：ATGGATCCACCCGAAATCACGGCCTACATAATCGGGGTTGCCGAAGGCCGCGGGACCAAGGAGGTGTTCCCCACGCTGCCGTACCTGGTGGGCCTCGCCGACGACCCGCCCAAGCCTCAACCCGCACCTAAGCCTGCTCCCTCTCCTGCGCCGGCCCCCGCACCGGCCCCCGCGCCAGCACCCAAGCCATCTCCTCCCGCGCCGCACCCCAAGGGCGACCACGTGCTCAAGGCGGTGGAATGGAAAGACGTTGACTCCAAAGACTACCCGCACTTCTTCACGGACATGTGCAAGTCCACGTGTCCGAAGGAGATGCAGCGCCGCGCGGCACACCACCTCAACCTCTGGGAGAGCATATCGGCCGGCACCGTCTCCACCAAGTACTCCGACGATGACTTCGTCCTGGTGGTCGACAACGACATGACCTTCCGCAAGCCCGAGATGGTAAAGCCGCTCATCGAGGCGATGAGGACGAACGGCTGGTACATGGCGCAGCTCAAGGAGACCTACATGACCGGCGCGCTGGCCACCAACGTCCCCGGCACCGGCGACCCCGAGCTCATGGTCTACCCCGGCGGGTACGACGTCTCGCTAGACGCCTACATCATCAACGTCGGCGGCATGAAGAAGCTCTACGACGCGATCATCAAGGAGGGAGGGCTGCGCAGCGGCCTGCTCACCGAGGTGTTCACGCTGGAGAAGCGGCTCTCTCTGGCGCGCGTGGTGCTCTCCGGCGCCGAGCAGGTGGTCTACCCCGAGTACTACATACAGGTGAAGACGCGGCTAAGCGGCGCGCCCTCCCTGTGGTCGCTGCTCGCCACGTGGCTGGCGCGCTTCTGGCCCGGCGCCATCTACTTCCTCACCACGCCGCTCTTCTCCTTCATGGGGCTCTTCGACGTGGACGTGGTCGACATCTTCATCCTGGCATACCTGCTGGTGCTCGTGCTGCTGCTGCCGAACTCGCGGCTGCTGTGGTTCATCGCCGGGCTGCTGGTCACGGCCATCGTGTGA.

M: Marker DL2 000;1: F1L基因PCR擴增產(chǎn)物;2: 陰性對照.圖2 F1L基因PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis of F1L amplified products

M: Marker DL2 000;1: F1LPCR擴增產(chǎn)物;2: 陰性對照.圖3 陽性質(zhì)粒PCR鑒定電泳結(jié)果Fig.3 Electrophoresis of F1L amplified products

M: Marker DL2 000;1: Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ酶切鑒定;M2: Marker DL 15 000.圖4 陽性質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果Fig.4 Identication of the positive plasmid

圖5 F1L基因核苷酸序列同源性比較Fig.5 Phylogenetic tree of F1L from ORFV

測序結(jié)果表明,鑒定正確的兩個質(zhì)粒序列完全相同,結(jié)果正確. 將所得羊傳染性膿皰病毒JLSY04株F1L基因的測序序列與GenBank中相應(yīng)核苷酸序列進行同源性比較,結(jié)果如圖5所示. 其中OV/7,OV/20,OV/C2為綿羊分離毒；OV/mi-90,OV/Torino為小羚羊分離毒株；NZ2作為標準毒株. 結(jié)果表明,JLSY04分離株與Jilin株的親緣關(guān)系最近,與OV/Torino株的親緣關(guān)系最遠.

利用DNAstar軟件對8個毒株相應(yīng)的F1L基因片段進行核苷酸和氨基酸同源性分析,結(jié)果分別如圖6和圖7所示.

1～8分別為JLSY04,Jilin,NZ2,OV/7,OV/20,OV/C2,OV/mi-90,OV/Torino.圖6 F1L基因的核苷酸序列同源性分析Fig.6 Nucleic acids sequence analysis of F1L from ORFV

1～8分別為JLSY04,Jilin,NZ2,OV/7,OV/20,OV/C2,OV/mi-90,OV/Torino.圖7 F1L基因的氨基酸同源性分析Fig.7 Amino acid homology analysis of F1L from ORFV

序列分析結(jié)果表明,JLSY04分離株的F1L基因片段與Jilin株同源性最高,為99.8%,與NZ2株同源性最低,為97.4%.

3 討 論

3.1 基因克隆DNA聚合酶的選擇

本文PCR擴增使用的PfuDNA聚合酶具有3′-5′的外切酶活性,能糾正DNA擴增過程中產(chǎn)生的錯誤.Pfu是目前已發(fā)現(xiàn)的所有耐高溫DNA聚合酶中出錯率最低的聚合酶,熱穩(wěn)定性較好. 利用PfuDNA聚合酶對羊傳染性膿皰病毒JLSY04株病毒DNA進行擴增,并對鑒定正確的隨機2個質(zhì)粒進行測序,由序列完全相同可見,該酶的重復性好,擴增效率高,錯賠率低,較穩(wěn)定.PfuDNA聚合酶擴增的PCR產(chǎn)物為平端,可通過酶切連接其他載體,若連接T載體,則需加poly A尾.

3.2 序列分析及同源性比較

本文將羊傳染性膿皰病毒JLSY04株F1L基因片段的核苷酸序列與已報道的羊傳染性膿皰病毒毒株相應(yīng)片段核苷酸序列進行了比較,由進化樹可見,從不同宿主和不同地區(qū)分離的毒株在遺傳進化上的差異較小,這是由于種間和地區(qū)差異所致. 同源性比較結(jié)果表明,JLSY04株與Jilin株同源性最高,為99.4%,與OV/Torino株的同源性最低,為96.0%,即F1L基因在不同感染動物分離病毒株間的差異較小. 由于F1L基因編碼的39 000蛋白高度保守,因此,羊傳染性膿皰病毒吉林株JLSY04F1L基因可作為基因工程疫苗的目的基因.

綜上,本文對羊傳染性膿皰病毒JLSY04株的F1L基因片段進行了核苷酸序列測定,并與多株參考毒株進行了同源性比較和分析,為進一步對該病毒的基礎(chǔ)研究和疫苗應(yīng)用提供了理論和實驗依據(jù).

[1] Rafii F,Burger D. Comparison of Contagious Ecthyma Virusgenomes by Restriction Endonucleases [J]. Arch Virol,1985,84(3/4): 283-289.

[2] SHAO Hong-ze,LIU Yun-zhi,CHENG Rong-hua,et al. Isolation and Identification ofOrfvirus[J]. Jilin Animal Science and Veterinary Medicine,2006(11): 11-12. (邵洪澤,劉云志,程榮華,等. 羊傳染性膿皰病毒的分離與鑒定 [J]. 吉林畜牧獸醫(yī),2006(11): 11-12.)

[3] ZHANG Jia-que,WU Jing-yang. An Investigation of Zoonosis ContagiousEcthymavirus[J]. Chinese Journal of Veterinary Medicine,2006,42(9): 53-54. (張家確,吳景央. 一起人畜共患羊傳染性膿皰病的調(diào)查 [J]. 中國獸醫(yī)雜志,2006,42(9): 53-54.)

[4] Lederman E R,Green G M,DeGroot H E,et al. ProgressiveOrfvirusInfection in a Patient with Lymphoma: Successful Treatment Using Imiquimod [J]. Clinical Infectious Diseases,2007,44(11): e100-e103.

[5] LUO Yun,SHEN Zhi-yi. Isolation and Biological Characterization ofOrfvirus[J]. China Animal Husbandry and Veterinary Medicine,2007,34(1): 94-96. (羅云,申之義. 羊傳染性膿皰病毒分離及生物學特性研究 [J]. 中國動物檢疫,2007,34(1): 94-96.)

[6] Scagliarini A,Ciulli S,Batmani M. Characterisation of Immunodominant Protein Encoded by theF1LGene ofOrfvirusStrains Isolated in Italy [J]. Arch Virol,2002,147(10): 1989-1995.

[7] Czerny C P,Waldmann R,Scheubeck T,et al. Identification of Three Distinct Antigenic Sites in Parapoxvirus [J]. Arch Virol,1997,142(2): 807-821.

[8] Scagliarini A,Gallina L,Pozzo F D,et al. Heparin Binding Activity ofOrfvirusF1L Protein [J]. Virus Research,2004,105(2): 107-112.

[9] Gallina L,Scagliarini A,Ciulli S,et al. Cloning and Expression of theOrfvirusF1LGene: Possible Use as a Subunit Vaccine [J]. Veterinary Research Communications,2004,28(1): 291-293.

[10] ZHAO Li-zhi,XUE Shuang-hu,Lü Wu-fu,et al. Cell Culture of ContagiousEcthymavirus[J]. Chinese Journal of Veterinary Medicine,1991,17(8): 12-13. (趙立志,薛雙虎,呂武夫,等. 羊傳染性膿皰皮炎病毒的細胞培養(yǎng) [J]. 中國獸醫(yī)雜志,1991,17(8): 12-13.)