RUNX3蛋白在宮頸癌中的表達及臨床意義

李朦，劉震，魏力

（中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院婦科，沈陽 110032）

宮頸癌是最常見的女性高發(fā)惡性腫瘤之一，近年來宮頸癌的發(fā)病率呈上升趨勢，而且發(fā)病有年輕化趨勢［1］。自上世紀70年代后，宮頸癌的病因學研究取得了重大進展，目前已明確高危人乳頭瘤病毒（human papillomavirous，HPV）感染［2］是宮頸癌發(fā)生的重要因素，同時還存在其他內源性和外源性因子的共同參與作用，其中抑癌基因功能的喪失和癌基因的表達是細胞癌變的分子基礎。人類Runt相關轉錄因子3（human runt related transcription factor 3，RUNX3）是Levanon等于1994年首次發(fā)現(xiàn)的一個新的腫瘤抑制基因，參與胚胎發(fā)育過程中細胞基因表達的調控。RUNX3是轉化生長因子β信號轉導通路中重要的下游調控轉錄因子，其信號紊亂將導致許多腫瘤的發(fā)生。實驗表明，RUNX蛋白可指導轉化生長因子β信號轉導過程中激活的Smad復合物，加強其與靶位點的結合強度并激活靶基因，從而對細胞的分化、細胞周期調控、凋亡和惡性轉化起作用［3］。目前，RUNX3 蛋白在肺癌［4］、胰腺癌［5］、肝細胞癌［6］等多種惡性腫瘤［7］中均有不同程度的轉錄失活或表達下調，而在宮頸癌中的研究不多，其在宮頸癌中表達的意義及在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過程中可能的作用機制尚不清楚。為此，本研究采用免疫組化方法檢測RUNX3蛋白在正常宮頸組織、宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）和宮頸癌組織中的表達并探討其臨床意義，為臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象與材料

收集2007年1月至2011年12月于我院保存的經(jīng)10%甲醛溶液固定、石蠟包埋的宮頸組織標本101例，患者年齡為26～63歲。其中宮頸癌標本48例，CIN標本33例，正常宮頸標本20例。按照國際婦產科聯(lián)盟（FIGO）2009年宮頸癌標準分期：Ⅰ～ⅡA期20例，ⅡB～Ⅳ期28例；病理分級：高分化25例，中低分化23例；病理分型：鱗癌44例，腺癌4例。其中20例Ⅰ～ⅡA期的宮頸癌標本均由患者行根治性全子宮切除術伴淋巴結清掃治療獲得，其余28例ⅡB～Ⅳ期的宮頸癌標本均為門診宮頸活檢獲得；術后病理證實存在淋巴結轉移者9例，無淋巴結轉移者11例。根據(jù)細胞異型程度及病變累及范圍進行CIN分級，其中CINⅠ16例、CINⅡ～Ⅲ17例。有病變的宮頸中HPV陽性60例，陰性21例。所有CIN及宮頸癌病患者術前均未進行放射、化學或生物治療，正常宮頸均來源于因子宮肌瘤行全子宮切除術且術后病理證實為慢性宮頸炎的患者。

1.2 免疫組化檢測

RUNX3兔抗人抗體為北京博奧森生物技術有限公司生產。SP試劑盒為康為世紀公司生產。免疫組化采用SP法。石蠟包埋組織常規(guī)脫蠟后PBS緩沖液沖洗，枸櫞酸鹽加熱型抗原修復后冷卻至室溫備用。用RUNX3抗體標記組織切片（1∶150），具體步驟參照試劑盒說明，然后經(jīng)DAB顯色，蘇木素復染。以PBS作為空白對照，已知陽性切片作為陽性對照。

1.3 免疫組化結果判定

采用半定量積分法判定結果，RUNX3蛋白主要在胞質中表達，以胞質出內現(xiàn)黃色至棕褐色顆粒判定為陽性。先按染色強度計分：0分，無色；1分，淺黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色。再按陽性細胞所占百分比計分：0分，陰性；1分，陽性細胞＆lt;10%；2分，10%～＆lt;50%；3分，50%～＆lt;75%；4分，≥75%。兩項得分相乘后判定免疫組化結果，陰性（-）：0～4分；弱陽性（+）：4～5分；中度陽性（++）：6～8分；強陽性（+++）：9～12 分。

1.4 病理學分級判定

G1級：非鱗狀或非桑葚樣生長類型＆lt;5%；G2級：非鱗狀或非桑葚樣生長類型為5%～＆lt;50%；G3級：非鱗狀或非桑葚樣生長類型≥50%。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析，采用χ2檢驗分析統(tǒng)計結果。P＆lt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

RUNX3蛋白在有病變的宮頸組織中表達較正常宮頸低，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（P＆lt;0.05）。不同病變程度宮頸組織中，RUNX3蛋白表達在CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ、宮頸癌中呈下降趨勢。早期（Ⅰ～ⅡA期）宮頸癌行手術治療，術后病理證實為宮頸鱗狀細胞癌、宮頸腺癌的宮頸組織中RUNX3蛋白表達的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；隨著臨床分期期別的增高及病理分級的增高，RUNX3蛋白的表達呈下降趨勢（P＆lt;0.05）；無淋巴結轉移比有淋巴結轉移的宮頸癌組織RUNX3蛋白表達陽性率高（P＆lt;0.05）；RUNX3蛋白表達在不同年齡的患者及有和無高危型HPV感染患者中的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1，圖1。

圖1 宮頸組織中RUNX3的表達 ×400Fig.1 Expression of RUNX3 protein in cervix issues ×400

3 討論

RUNX3定位于人染色體1p36.1，廣泛表達于上皮細胞、血液細胞、神經(jīng)細胞等。大量研究［8］表明，RUNX3可能是新的抑癌基因，廣泛表達于多種細胞中；動物實驗證明其對上皮細胞的增生及人類多種惡性腫瘤的形成均有重要調節(jié)作用。研究［9］發(fā)現(xiàn)，約有60%人胃癌組織中RUNX3蛋白表達下調或者缺失，早期胃癌組織約40.9%出現(xiàn)RUNX3蛋白表達下調，而進展期胃癌組織RUNX3蛋白表達下調幾乎達到87.5%。按正常宮頸—CIN—宮頸癌的發(fā)展，RNX3的表達存在下降趨勢符合宮頸癌［10］的發(fā)展變化，RUNX3可能作為一種抑癌基因參與宮頸癌的發(fā)生。還有研究表明RUNX3蛋白不僅對腫瘤的形成產生作用，而且對腫瘤的惡性程度、侵襲、轉移及預后有影響。有研究選擇食管鱗癌，發(fā)現(xiàn)在早期腫瘤中RUNX3陰性表達時腫瘤中淋巴道侵襲能力和淋巴結轉移數(shù)目均明顯增高；RUNX3陰性表達與腫瘤預后不良相關；RUNX3可能是影響預后的重要因素。

表1 RUNX3蛋白的表達與宮頸組織中的表達及臨床病例參數(shù)之間的關系Tab.1 Relationship between RUNX3 protein expression and clinicopathological parameters and expression in cervix tissues

本研究發(fā)現(xiàn)隨著宮頸病變程度的進展，宮頸組織中RUNX3蛋白表達陽性率逐漸下降，從蛋白水平驗證了RUNX3基因表達水平的降低，也從側面驗證了RUNX3是一種抑癌基因，與上述文獻報道結果相符。此外本研究還表明，RUNX3蛋白與臨床病理分級密切相關，隨著宮頸癌的發(fā)展，RUNX3陽性表達率下降，進一步說明了隨著腫瘤的發(fā)展RUNX3表達下降，提示RUNX3蛋白可能不僅與宮頸癌的發(fā)生有關，而且與宮頸癌的病情進展也存在密切聯(lián)系。但是本研究僅通過免疫組化的方法從蛋白水平驗證了宮頸組織中RNUX3的表達情況，并未從基因水平進行研究，需要進一步通過實驗驗證。本研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌中RUNX3蛋白的表達與患者的年齡、腫瘤的病理類型、高危型HPV感染未見顯著相關，可能與收集了年齡偏小且惡性程度較高的宮頸癌病例有關。此外，宮頸鱗狀細胞癌和腺癌比較RUNX3蛋白表達的差異無統(tǒng)計學意義，可能與收集的宮頸腺癌樣本量少有關。RUNX3蛋白的表達與高危型HPV感染是否相關還需進一步研究。

從目前國內外關于RUNX3蛋白的大多數(shù)研究中我們可以發(fā)現(xiàn)，其在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及預后方面的研究正在不斷的深入。RUNX3可能作為一個惡性腫瘤的生物學標志，同時可能作為一個腫瘤的基因治療新靶點。進一步探索RUNX3蛋白的表達調控及其分子機制與宮頸病變的關系，將可能為宮頸癌的診斷、治療提供有價值的線索。

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